论文信息
标题：Carbonothioate-Triggered Cascade Cyclization Enables High–Specificity Fluorescence Imaging of Hydrogen Polysulfides.
作者：Jie Zhang, Meng He, Minrong Huang, Le Liu, Yuxin He, Deming He, Feiyi Wang, and Wei Chen
第一作者：张洁、何梦
通讯作者：陈巍教授
通讯单位：华中科技大学
研究背景
多硫化氢（H₂Sₙ；n>1）是一类高活性含硫信号分子，因其独特的调节功能和与生物过程中硫化氢（H₂S）信号的密切联系而受到广泛关注。从化学角度来看，由于α-效应，在生理条件下，H₂Sₙ的反应性应该比H₂S强。最近的报告表明，H₂Sₙ在激活离子通道、肿瘤抑制因子、转录因子和蛋白质S-巯基化方面比H₂S更有效。H₂Sₙ生物学的研究正在快速发展，但由于其不稳定性和高反应性，仍然具有挑战性。为了更好地揭示这些生物功能背后的确切作用机制，研究H₂Sₙ的基本反应并开发可靠的检测方法至关重要。
目前，H₂Sₙ的典型检测方法依赖于紫外-可见（UV）光谱、质谱和高效液相色谱（HPLC）分析，由于灵敏度低和可操作性有限，这些方法不适用于活体生物样本的检测。相比之下，荧光探针由于其高灵敏度和时空分辨率，可以成为检测H₂Sₙ的非常强大的化学工具。自从Xian的团队在2014年首次报道了基于2-氟-5-硝基苯甲酸酯触发物（DSP型）的H₂Sₙ特异性荧光探针以来，已经开发了许多H₂Sₙ特异触发物的H₂Sₙ探针，包括2-（苯甲酰基硫代）苯甲酸苯酯（PSP型）、氮丙啶、α，β-不饱和酯等。大多数可用的H₂Sₙ探针很容易受到生物硫醇或H₂S的干扰，从而显著降低了检测灵敏度。为了解决这个问题，一种有效的策略是用H₂Sₙ特异性触发器代替2-氟-5-硝基苯甲酸酯，该触发器仅与H₂Sₙ反应并快速释放荧光团，而不与生物硫醇相互作用。
本文亮点
1）新型H₂Sₙ触发机制：首次提出基于硫代羰酸酯的级联环化反应策略，能够有效避免生物硫醇干扰。
2）成像突破：首次实现胰岛素抵抗细胞与2型糖尿病（T2DM）小鼠模型中内源性H₂Sₙ的荧光成像。
研究内容
鉴于H₂Sₙ既能作为亲核试剂又能作为亲电试剂，且其亲核性强于生物硫醇或H₂S。利用这一特性，作者提出了一种新型探针模板I，可特异性识别H₂Sₙ。与先前报道的PSP型探针不同，采用不同的供电子基团替代苯甲酰基中的苯环，从而显著降低羰基碳的亲电性。该设计应能更有效地抑制探针与生物硫醇或H₂S之间的反应。此外，修饰I中的X或R基团将显著影响其对H₂Sₙ的反应速率，并调节探针的水溶性。若H₂Sₙ能选择性地与含有特殊X和R基团的触发剂反应，则生成的中间体II会继续与H₂Sₙ（作为亲电试剂）反应生成III。随后的自发环化反应将释放酚类荧光团。因此，这种级联环化反应对H₂Sₙ具有高灵敏度和特异性。
图1：H₂Sₙ响应荧光探针的级联环化反应策略（图源：Angew. Chem.）
考虑到上述因素，使用常见的酚类荧光染料3’-O-甲基荧光素（MF）制备了一个小型探针库（CTP1-7）。通过使用不同的X和R基团，研究了供电子基团对探针与H₂Sₙ反应速率的影响，引入多个乙氧基链或季铵盐可能增强探针的水溶性。利用这些探针，首先研究了它们的光谱特性及对H₂Sₙ的响应。除CTP-3外，所有探针均在452 nm和472 nm处呈现强吸收峰，且512 nm处的荧光强度显著增强。强供电子甲氧基取代基（X为O，R为-CH₃）比N，N-二甲基基团（X为N，R为-（CH₃）₂更有效。CTP-3中体积较大的叔丁基基团可能降低了其对H₂Sₙ的反应活性。此外，CTP-7表现出比其他探针更强的荧光增强效应，表明季铵盐单元能更有效地促进探针与H₂Sₙ之间的反应。虽然CTP-7的伪一级速率常数k’明显高于CTP-2（CTP-7为0.74 min⁻¹，CTP-2为0.089 min⁻¹），但在生物硫醇存在时，CTP-2展现出比CTP-7更优异的稳定性。CTP-2凭借其优异的传感性能展现出最大潜力，因此被选为后续研究的重点对象：CTP-2对H₂Sₙ的检测具有高选择性、高灵敏度（检测限为63 nM）。
图2：CTP 1-7对H₂Sₙ的光谱响应（图源：Angew. Chem.）
为进一步验证硫代羰酸酯触发剂在其他含光调谐酚羟基荧光团的探针中的适用性，采用与CTP-2相同的触发策略合成了新型近红外（NIR）探针CTP-8。该探针整合了广泛使用的近红外二氰基异佛尔酮荧光团，并在体外实现了对H₂Sₙ的高效能检测。
图3：CTP 8对H₂Sₙ的光谱响应（图源：Angew. Chem.）
CTP-8实现了在HepG2细胞和Raw264.7细胞中外源性H₂Sₙ的可视化，并检测到LPS诱导的Raw264.7细胞H₂Sₙ上升。该探针首次实现了在胰岛素抵抗细胞和2型糖尿病小鼠模型中内源性H₂Sₙ的动态变化。
图4. HepG2细胞和RAW264.7细胞中H₂Sₙ的荧光成像（图源：Angew. Chem.）
图5. T2DM小鼠H₂Sₙ的荧光成像（图源：Angew. Chem.）
总结
本研究成功开发出一种基于硫代碳酸酯的新型触发剂，通过级联环化反应实现对H₂Sₙ的高度灵敏特异性检测。基于这一创新策略，制备了H₂Sₙ特异性NIR荧光探针CTP-8，该探针不仅能实现H₂Sₙ的高灵敏度检测，还可对活细胞和活体内的H₂Sₙ进行定量成像。值得注意的是，本研究首次实现了在胰岛素抵抗细胞和2型糖尿病小鼠模型中观察到内源性H₂Sₙ动态变化。这一发现揭示了H₂Sₙ在代谢失调中的潜在作用，为代谢疾病研究提供了重要启示。此外，由于该硫代碳酸酯触发剂可应用于其他含光学可调酚羟基的荧光染料骨架结构，作者认为这项研究将为推进H₂Sₙ生物学研究及指导未来探针开发提供重要工具。
通讯作者简介
陈巍，教授，博士生导师，国家高层次青年人才，中国光学学会生物医学光子学专业委员会委员，中国分析测试协会生物传感专业委员会委员。2013年1月毕业于中国科学院化学研究所，获分析化学理学博士。一直从事生物体内活性物质的成像探针研究。已在Angew. Chem. Int. Ed.、J. Am. Chem. Soc.、Chem. Soc. Rev.、Redox Biology等国际学术期刊上发表学术论文40余篇。中国授权发明专利2项，美国授权发明专利2项。