导语

 
结果：

QPCT 基因在 LUAD 患者组织中表达上调
两种具有谷氨酰胺环化酶活性的同工酶，QPCT 和谷氨酰胺肽环化酶样（QPCTL），已被鉴定为在多种癌症中作为关键效应因子，通过参与肿瘤免疫调节 [9 , 27 ]。为研究 QPCT/QPCTL 在肺腺癌（LUAD）中的表达变化，作者从 GEO 数据库下载了多个 LUAD 相关基因表达数据，发现 QPCT（而非 QPCTL）在 LUAD 中高表达 ( Figure 1A )。通过从基因表达谱交互分析获得的元数据也验证了 QPCT 的高表达 ( Figure 1B )。全癌症基因表达分析显示，QPCT 在包括 LUAD 在内的多种癌症中差异表达 ( Supplementary Figure 1 )。如图 Figure 1C 和 1D 所示，临床 LUAD 标本中 QPCT 的 mRNA 和蛋白表达均上调。LUAD 中 QPCT 表达的差异促使作者评估 QPCT 在 LUAD 中的表达是否与人类肿瘤特征相关。使用包含 97 个人类 LUAD 标本的肿瘤组织学阵列进行 QPCT 的免疫组化（IHC）染色 ( Figure 1E )。QPCT 表达与肿瘤特征之间的关系如图 Table 1 所示。 高 QPCT 表达与 TNM 分期（χ 2 = 23.74，p 值<0.0001）和转移（χ 2 = 12.82，p 值=0.0003）显著相关。

QPCT 基因在肺腺癌（LUAD）患者组织中表达上调。A. 基因表达热图显示 Gene Expression Omnibus 数据库中 LUAD 中 QPCT 和 QPCTL 的表达。B. 从癌症基因组图谱（TCGA）数据库和基因型组织表达（GTEx）中提取的 LUAD/正常组织中的 QPCT 表达，使用 GEPIA 网站。T 代表肿瘤组织，N 代表正常组织。C. 临床 LUAD 和癌旁标本中的 QPCT mRNA 表达。D. 四对 LUAD 和配对癌旁肺组织中的 QPCT 蛋白表达。P 代表癌旁标本。E. 临床 LUAD 组织样本中高和低 QPCT 表达的代表性免疫组化图像。200×标尺=100 μm。400×标尺=50 μm。**p 值 < 0.01。带条形图的散点图表示平均值 ± 标准差（SD），而箱线图表示中位数、四分位数、范围和单个数据点。QPCT，谷氨酰基肽环转移酶；QPCTL，谷氨酰基肽环转移酶样。
敲低 QPCT 抑制 LUAD 细胞的增殖
稳定过表达 QPCT 的 HCC44 细胞和稳定转染 QPCT shRNA 的 A549 细胞被用于探索 QPCT 对 LUAD 细胞增殖的影响。验证了 QPCT 过表达和敲低的效率（Figure 2A 和 2D ）。QPCT 的过表达显著促进 HCC44 细胞增殖，始于培养 48 小时后（ Figure 2B ）。同样，EdU 染色也显示过表达 QPCT 的细胞表现出更多的细胞生长（ Figure 2C ）。CCK-8（ Figure 2E ）和 EdU 染色（ Figure 2F ）的结果表明 QPCT 的敲低抑制了 A549 细胞的增殖。

Am J Cancer Res | FTO 介导的QPCT的 m6A 修饰通过诱导巨噬细胞趋化性和 M2极化促进肺腺癌的肿瘤发生
敲低 QPCT 抑制肺腺癌（LUAD）细胞的增殖。建立了稳定过表达或敲低 QPCT 的 HCC44 和 A549 细胞系（上排）。(A)通过蛋白质印迹分析验证了 HCC44 细胞中 QPCT 过表达的效率。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（B）和 EdU 实验检测 QPCT 过表达对细胞增殖的影响。*p 值<0.05，**p 值<0.01。(D)通过蛋白质印迹分析验证了 A549 细胞中 QPCT 的敲低效率。**p 值<0.01，##p 值<0.01，与 LV-shNC 组相比。进行 CCK-8 实验（E）和 EdU 染色（F）以确定 A549 细胞的增殖情况。*p 值<0.05，**p 值<0.01；LV-shQPCT-1 与 LV-shNC 组相比。#p 值<0.05，##p 值<0.01；LV-shQPCT-2 与 LV-shNC 组相比。数据以平均值±标准差（SD）表示。LV-VE，载体对照慢病毒；LV-QPCT，QPCT 过表达慢病毒；LV-shNC，阴性对照慢病毒；LV-shQPCT-1/2，QPCT shRNA 慢病毒；QPCT，谷氨酰肽环化酶。
在肺腺癌（LUAD）细胞中沉默 QPCT 会抑制巨噬细胞趋化性和 M2 巨噬细胞极化
如Figure 3A 和 3B 中所述，QPCT 过表达的 HCC44 细胞上清液中的 CCL2 浓度显著增加，而在稳定转染 QPCT shRNA（shQPCT）的 A549 细胞中则显著降低。QPCT 的过表达显著增加了迁移到下室的 THP-1-M0 细胞数量（ Figure 3C ），而 QPCT 的敲低则产生了相反的效果（ Figure 3D ）。为了测试 QPCT 表达的变化如何影响 M2 巨噬细胞极化，作者将 IL-4 和 IL-13 添加到下方的 transwell 室中，以分化 THP-1-M0 细胞[ 8 ]。CD68 + 和 CD206 + 是不同巨噬细胞身份的标志物，CD68 + /CD206 + 细胞与总 CD68 + 细胞的比例可用于测量 M2 巨噬细胞的群体数量[ 28 ]。作者发现，与 QPCT 过表达的 HCC44 细胞共培养的 THP-1-M0 细胞中，CD68 + /CD206 + 细胞的百分比以及 Arg1 和 CD206 的蛋白表达增加（ Figure 3E-G ），表明 QPCT 过表达诱导了 M2 巨噬细胞极化。相反，QPCT 的抑制导致 THP-1-M0 细胞中 CD68/CD206 双阳性细胞减少，以及 Arg1 和 CD206 蛋白表达的降低（ Figure 3E ， 3F 和 3H ）。 如 Figure 3I-P 中详细所述，当 THP-1-M0 细胞与 HCC44/A549 细胞的条件培养基共培养时，作者得到了相似的结果。这些结果表明 QPCT 过表达导致了 CCL2 含量的增加、巨噬细胞向 LUAD 细胞的迁移以及 M2 巨噬细胞的分化，而沉默 QPCT 可以阻止这一过程。

在肺腺癌（LUAD）细胞中沉默 QPCT 可抑制巨噬细胞趋化和 M2 巨噬细胞极化。HCC44 细胞（A）和 A549 细胞（B）培养上清液中的 CCL2 水平。（C，D）通过结晶紫染色和计数下室膜中的细胞，测定 QPCT 对 LUAD 细胞系中巨噬细胞趋化的影响。200×标尺=100 μm。（E）建立共培养转皿系统，研究 LUAD 细胞对 THP-1 来源的 M0 巨噬细胞（THP-1-M0）的 M2 极化影响。（F）流式细胞术分析 CD68/CD206 双阳性细胞的比例。（G，H）对（F）中流式细胞术结果的定量分析（上排）和 THP-1-M0 中 Arg1 和 CD206 的 Western blot 分析（下排）。（I）转皿迁移实验使用 THP-1-M0 细胞在上室，转染的 HCC44 和 A549 细胞的条件培养基在下室。（J-L）通过结晶紫染色和定量分析转皿室膜下侧迁移的细胞。200×标尺=100 μm。 (M) 将 THP-1-M0 细胞在添加了 IL-4 和 IL-13 的 HCC44 或 A549 条件培养基中培养，以研究转染的 LUAD 细胞的条件培养基对 THP-1-M0 细胞 M2 极化的影响。(N) 使用流式细胞术检测 CD68/CD206 阳性细胞的百分比。(O, P) 流式细胞术结果的定量分析（上排）以及使用 Western blot 检测 THP-1-M0 细胞中 Arg1 和 CD206 蛋白表达的检测（下排）。对于 HCC44 细胞，**表示与 LV-VE 组相比 p 值<0.01。对于 A549 细胞，**/##表示与 LV-shNC 组相比 p 值<0.01。数据以平均值±标准差（SD）表示。LV-VE，载体对照组慢病毒；LV-QPCT，QPCT 过表达慢病毒；LV-shNC，阴性对照组慢病毒；LV-shQPCT-1/2，QPCT shRNA 慢病毒；PMA，12-肉豆蔻酰基佛波醇-13-乙酸；QPCT，谷氨酰肽环化酶；CCL2，趋化因子 C-C 基序配体 2。
QPCT 敲低通过抑制巨噬细胞趋化性和 M2 巨噬细胞极化，抑制裸鼠中的人 LUAD 细胞肿瘤生长
作者评估了 QPCT 敲低对裸鼠异种移植肿瘤生长的影响，发现由稳定转染 shQPCT 的 A549 细胞诱导的肿瘤，其大小显著小于由亲本细胞或表达 shNC 的 A549 细胞诱导的肿瘤（ Figure 4A-C ）。从细胞注射后的第 10 天开始，LV-shQPCT-1 组裸鼠的肿瘤体积明显小于 LV-shNC 组裸鼠的肿瘤体积，而 LV-shQPCT-2 组裸鼠的肿瘤体积从第 13 天开始显著减小（ Figure 4B ）。LV-shQPCT-1 介导的 QPCT 敲低显著降低了肿瘤重量，而 LV-shQPCT-2 则没有这种效果（ Figure 4C ）。QPCT 的缺失通过 WB 检测得到验证（ Figure 4D ）。Ki-67 的免疫组化染色（ Figure 4E ）进一步表明，QPCT 沉默抑制了 LUAD 中增殖标记物 Ki-67 的表达。这些结果表明，QPCT 敲低显著抑制了 LUAD 细胞的致瘤能力。如 Figure 4F 所示，QPCT 的敲低抑制了 LUAD 肿瘤中人类 CCL2 蛋白的表达。此外，QPCT 的缺失减少了肿瘤组织中的 mCD68 阳性细胞（ Figure 4G ）。 Western Blot 实验结果揭示了 QPCT 敲低显著抑制了裸鼠肿瘤中小鼠 Arg1 蛋白的表达（ Figure 4H ）。这些结果表明，QPCT 的敲低通过减少 CD68 + 细胞向肿瘤的募集以及 CCL2 信号通路调控下的巨噬细胞 M2 极化，抑制了异种移植肿瘤的生长。

QPCT 敲低通过抑制巨噬细胞趋化性和 M2 巨噬细胞极化，抑制裸鼠中人肺腺癌（LUAD）细胞的肿瘤生长。A.动物实验流程图及第 28 天解剖肿瘤照片。B.肿瘤体积。*p 值<0.05，**p 值<0.01；LV-shQPCT-1 与 LV-shNC 组比较。##p 值<0.01；LV-shQPCT-2 与 LV-shNC 组比较。C.肿瘤重量。D.通过蛋白质印迹实验验证 QPCT 敲低效率。E.人肺腺癌肿瘤中 Ki-67 的免疫组化。400×标尺=50 μm。F.人肺腺癌肿瘤中 hCCL2 蛋白表达。G.人肺腺癌肿瘤中 mCD68（红色）和 DAPI（蓝色）的免疫荧光染色。400×标尺=50 μm。H.人肺腺癌肿瘤中 mArg1 蛋白表达。**p 值<0.01，#p 值<0.05，##p 值<0.01，ns=无显著差异，与 LV-shNC 组比较。数据以平均值±标准差（SD）表示。LV-shNC，阴性对照慢病毒；LV-shQPCT-1/2，QPCT shRNA 慢病毒；QPCT，谷氨酰肽环转移酶；CCL2，趋化因子 C-C 基序配体 2。
m6A 的失调修饰导致 LUAD 中 QPCT mRNA 的上调
根据生物信息学分析，QPCT（Supplementary Figure 2 ）上存在 m6A 修饰位点。MeRIP-PCR 结果说明 QPCT mRNA 在 A549 细胞中被 m6A 修饰（ Figure 5A ）。m6A 去甲基酶 FTO 已被报道在肺腺癌（LUAD）的肿瘤发生中发挥作用[ 21 – 23 ]。为探究 FTO 是否与 QPCT 表达水平相关，检测了临床 LUAD 样本中 FTO 的 mRNA 表达。与癌旁组织相比，人 LUAD 组织中 FTO mRNA 表达显著上调（ Figure 5B ）。作者发现临床 LUAD 样本中 QPCT 与 FTO mRNA 表达呈显著正相关（ Figure 5C ）。如 Figure 5D 所述，RIP-PCR 结果显示 FTO 与 QPCT mRNA 结合。使用两个特异性 siRNA 靶向 FTO 以探索 m6A 修饰对 QPCT mRNA 稳定性的影响。FTO 敲低在蛋白水平得到验证（ Figure 5E ）。使用敲低效率更高的 siRNA siFTO-2 进行后续实验。此外，MeRIP-qPCR 检测表明 FTO 敲低显著增加了 QPCT mRNA 转录本上的 m6A 水平（ Figure 5F ）。 此外，敲低 FTO 降低了 A549 细胞中 QPCT 的 mRNA 表达水平（ Figure 5G ）。为了进一步验证 FTO 对 QPCT RNA 稳定性的影响，作者在敲低 FTO 后用转录抑制剂放线菌素 D 处理 A549 细胞。作者发现 FTO 缺失抑制了 QPCT mRNA 的降解（ Figure 5H ）。这些结果表明，QPCT 的 m6A 修饰影响了其在 A549 细胞中的 mRNA 稳定性。

m6A 的失调修饰导致肺腺癌（LUAD）中 QPCT mRNA 的上调。A. 采用甲基化 RNA 免疫沉淀 PCR（MeRIP-PCR）检测 A549 细胞中 QPCT m6A 修饰水平。B. 临床肺腺癌（LUAD）和癌旁组织中 FTO mRNA 表达。C. 临床 LUAD 组织中 FTO 与 QPCT mRNA 表达的相关性。数据以散点图形式展示，并呈线性拟合。D. 采用 RNA 免疫沉淀 PCR（RIP-PCR）验证 FTO 与 QPCT mRNA 的结合。E. 通过检测 A549 细胞中 FTO 蛋白表达验证 FTO 敲低效果。**/##p 值<0.01，与 siNC 组相比。ns=无显著差异。F. 采用 MeRIP-qPCR 检测 A549 细胞中 FTO 介导的 QPCT m6A 修饰。**p 值<0.01，与 siNC 组相比；##p 值<0.01，与 siFTO-2 组相比。^^p 值<0.01。G. 采用实时定量 PCR（Rt-qPCR）检测 A549 细胞中 QPCT mRNA 表达。**p 值<0.01。H. 不同时间点（10 μg/mL）actinomycin D 处理 A549 细胞后的 QPCT mRNA 表达。 **p 值<0.01。散点图加条形图表示平均值±标准差（SD）。m6A，N6-甲基腺苷；siNC，阴性对照 siRNA；si-FTO，FTO siRNA；QPCT，谷氨酰肽环转移酶；FTO，与脂肪量和肥胖相关的蛋白。**
FTO 调节 QPCT 对巨噬细胞趋化性和 M2 巨噬细胞极化的影响
靶向 FTO 的 siRNA 用于沉默在稳定过表达 QPCT 的亲本细胞或 HCC44 细胞中 FTO 的表达（Figure 6A ）。如图 Figure 6B 所示，在敲低 FTO 的细胞中，QPCT 的过表达显著增加了 HCC44 细胞条件培养基中的 CCL2 含量。FTO 的缺失显著减少了迁移到 HCC44 条件培养基中的 THP-1-M0 细胞数量（ Figure 6C 和 6D ）以及 HCC44 细胞中 CD68/CD206 双阳性细胞的百分比（ Figure 6E 和 6F ），而 QPCT 的过表达则逆转了这一趋势。这些结果表明，QPCT 对 TAMs 趋化和巨噬细胞 M2 极化的影响在 LUAD 细胞中受 FTO 调控。

FTO 调节 QPCT 对巨噬细胞趋化性和 M2 巨噬细胞极化的影响。(A) 条件培养基制备的简化过程。(B) 条件培养基中的 CCL2 浓度。代表性的紫晶染色图片显示了 transwell 室下膜的 THP-1-M0 细胞 (C) 和定量分析 (D)。200× 标尺 = 100 μm。(E) 流式细胞术检测在添加 IL-4 和 IL-13 的 HCC44 条件培养基中 CD68+ /CD206 + 细胞的百分比。(F) (E) 中流式细胞术结果的定量分析。**p 值 < 0.01，*p 值 < 0.05。数据以平均值 ± 标准差 (SD) 表示。LV-VE，载体对照慢病毒；LV-QPCT，QPCT 过表达慢病毒；siNC，阴性对照 siRNA；si-FTO，FTO siRNA；QPCT，谷氨酰肽环转移酶；FTO，脂肪量和肥胖相关蛋白；CCL2，趋化因子 C-C 基序配体 2。

总结

总之，作者发现 QPCT 在临床 LUAD 样本中高表达，其高表达与 LADC 患者中的恶性表型相关。QPCT 敲低通过抑制巨噬细胞 M2 极化及 CCL2 诱导的 TAMs 趋化性，在体内和体外均抑制 LUAD 细胞增殖。机制研究表明，FTO 介导的脱甲基化增加了 LUAD 细胞中 QPCT mRNA 的稳定性，这影响了 QPCT 对 TAMs 趋化性和 M2 极化的作用。。