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结果：
TEM 和 SEM 图像描绘了由E. billardieri 合成的 Ag–Cu 双金属纳米粒的形态特征。TEM 显微镜结果[ Figure 1 a]显示，掺杂的纳米粒具有近球形的结构，平均尺寸约为 12 ± 9.7 nm。需要注意的是，TEM 检测到的纳米粒尺寸小于其他尺寸检测结果，因为用于形态分析的纳米粒是干燥形式。SEM 图像[ Figure 1 b]展示了具有相互连接孔隙的纳米粒的三维结构。合成的 Ag–Cu 复合纳米结构表现出 Ag–Cu 的不均匀分布。水提物的功能性植物成分与这些纳米结构相互作用，产生的 Ag–Cu 的微观结构显示出光滑的表面。
(a) TEM, (b) FE-SEM, 和 (c) EDAX of Ag–Cu 纳米粒
研究 NPs 结构中使用的元素由该图所示的峰指示。采用 X 射线分析来识别这些元素。在Figure 1 c 中，这种分析方法证实了银和铜 NPs 的存在。从 EDAX 光谱的值来看，化学计量学证实了元素组成的存在：铜（Cu）、碳（C）和银（Ag）。观察结果支持 Ag 的掺入 Cu 中，并证实了 Ag 掺杂 CuNPs 的形成。在 Ag–CuNPs 的元素组成 EDAX 分析中，Cu、C 和 Ag 的重量百分比分别报告为 24.2%、7.5%和 65.3%。
红外光谱（FT-IR）用于检测辐射的吸收并分析分子和多原子离子的振动。3436 cm−1 处的峰可能表明醇和酚类 O-H 基团的伸缩振动。2078 cm−1 处的另一个峰对应 C = N。1637 cm−1 区域内的峰与 C = C 和 C = O 有关。下一个 641 cm−1 处的峰证实了烷烃和 C-H 键的存在[ Figure 2 a]。根据 FTIR 光谱获得的结果，该光谱基于辐射吸收和分子振动分析，用于确定结构、测量化学物质和鉴定有机化合物。FTIR 分析表明，植物水提物和纳米粒子的相互作用不同，导致出现不同的峰。2942 cm−1 区域内的峰证实了烯键的存在。2832 cm−1 处的峰表明存在 C = C 和 C-H 羧酸键。1740 cm-1 区域内的峰表示存在于酯中的 C = O 键。 位于 1423 cm−1 处的峰表示芳香键。最后，位于 666 cm−1 处的峰确认了烯烃中的 C-H 键和胺中的 N-H 键的存在[ Figure 2 b]。XRD 图谱被用于评估本研究合成的材料的质量。在这种方法中，通过 X 射线衍射来检测合成材料的晶体结构。具体来说，根据研究结果表明的 XRD 图谱中的 2θ值，可以确认银铜纳米粒子存在于 24、28、36、47、53 和 64 度的角度[ Figure 2 c]。当不存在 Cu (OH) 2 和 Ag 时，峰显示出良好的结晶性质，这由 X 射线衍射图谱解释，该图谱也确认了 Cu 纳米粒子的存在。
(a) 提取物的傅里叶变换红外光谱，(b) Ag–Cu 纳米粒子，(c) Ag–Cu 纳米粒子的 X 射线衍射图谱
利用 MTT 试验，评估了受试细胞在合成 NPs 和提取物不同浓度作用下的活力。三种孵育时间的 MTT 结果如图 0 所示。图 1 显示了 Ag–Cu NPs 和提取物的 IC50 值。NPs 和提取物均以时间和剂量依赖的方式诱导细胞死亡。针对 HEK293 处理的 IC50 值（约 190 µg/mL）较高，表明其具有良好的生物相容性[Figure 3 a 和 b]。此外，在孵育的每个时间点，Ag-Cu NPs 的细胞毒性效应均显著高于对照组和提取物处理组。如图 3b 和 d 所示的结果表明，与对照组相比，Ag–Cu NPs 对 PC-3 细胞系有显著影响。值得注意的是，在 100 µg/mL 的浓度下，合成银铜 NPs 的效果更为明显。此外，在 12.5 µg/mL 的浓度下，24 小时后约 50%的细胞存活。对于植物提取物，在 12.5 µg/mL 的浓度下，细胞的存活率约为 85%。植物提取物的平均 IC50 值为 21.43 µg/mL，而合成 NPs 的平均 IC50 值为 15.42 µg/mL。 对 LNCaP PC 细胞进行了类似的测试，结果如图 4e 和 f 所示，表明 Ag–Cu NPs 在所有测试浓度下均对癌细胞的生长和增殖具有显著的抑制作用。在 12.5、25、50 和 100 µg/mL 的浓度下观察到最显著的效果。在 50 和 100 µg/mL 的浓度下，植物提取物与对照组相比效果稍弱但仍可接受（P < 0.05）。Ag–Cu NPs 和提取物对 LNCaP 细胞的平均 IC50 值分别为 7.64 µg/mL 和 13.58 µg/mL。结果表明，生物合成 NPs 对癌细胞的影响比提取物更大。据信，癌细胞通过增加代谢率和相对缺氧产生比正常细胞更多的 ROS。与 HEK293 相比，Ag–Cu NPs 对 PC-3 和 LNCaP 的选择性细胞毒性值分别为 12.25 和 24.75。计算出的癌细胞选择性为 2.02，表明 NPs 对 LNCaP 细胞的毒性更强。这两种细胞系被广泛用作低和高转移潜能的细胞模型。 所获得的 IC50 值随后用于进行凋亡测试（流式细胞术）、基因表达分析以及评估活性氧（ROS）的产生。
体外细胞毒性实验：E. billardieri 提取物和 Ag-Cu 纳米粒子的细胞毒性。MTT 实验结果，分别对 HEK-293、PC-3 和 LNCaP 细胞用 E. billardieri 处理 24、48 和 72 小时（a、c 和 e）。MTT 实验结果，分别对 HEK-293、PC-3 和 LNCaP 细胞用 Ag-Cu 纳米粒子处理 24、48 和 72 小时（b、d 和 f）
暴露于 Ag–Cu NPs 和植物提取物中的 PC-3 和 LNCaP 细胞的基因表达谱如图 0a 和 b 所示。血管生成诱导因子 VEGF mRNA 在用生物合成 NPs 处理的两种细胞系中均显著降低（PC-3 和 LNCaP 分别P < 0.01 和 P < 0.001）。植物提取物的抑制 VEGF 表达活性在两种提取物处理的细胞系中均无显著差异。在作者的项目中，生物合成 NPs 使两种细胞系的 MMP2 和 MMP9 mRNA 水平降低了对照组表达水平的一半。暴露于植物提取物后观察到 0.8 倍的改变。正如预期，NPs 在降低 MMP9 基因表达方面比植物提取物效果更显著。此外，NPs 通过降低 MMP9 表达对 LNCaP 细胞系更有效。 对于 MMP2 基因，纳米颗粒对 MMP2 表达的降低趋势与 MMP9 相似。值得注意的是，生物合成纳米颗粒对 MMP2 的影响高于 MMP9，而提取物的效果相同。尽管提取物导致 Bcl2 表达降低，但无法在统计学上认为显著。Bax 是一种促凋亡效应因子。Ag–Cu 纳米颗粒的暴露使 PC-3 和 LNCaP 中的 Bax mRNA 水平分别增加了 4.5 倍和 4.3 倍。而作者的植物提取物使 Bax 表达增加约两倍，但效果不如纳米颗粒。Bcl2 和 Bax 表达的变化可视为由 E. billardieri 生物合成的 Ag–Cu 具有相对促凋亡诱导能力。当前结果支持 Bax 和 Bcl2 在 mRNA 水平上的促凋亡比率。植物提取物和 Ag–Cu 纳米颗粒均促使 caspase-3 和 caspase-9 表达上升；然而，纳米颗粒对这两种细胞系的影响更为显著。 与植物提取物相比，纳米颗粒对 caspase3 基因表达的升高具有更显著的效果，在 P < 0.001 和 P < 0.05 水平上存在统计学显著差异。
Bax、Bcl2、caspase3、caspase3、VEGF、MMP2 和 MMP9 的表达水平在(a) PC-3、(b) LNCaP 细胞系中，经提取物 IC50 浓度及 Ag–Cu NPs 处理 24 小时后的表达水平。(*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，和****：P < 0.0001）
为了更详细地研究细胞死亡（凋亡或坏死），采用了 Annexin V-PI 流式细胞术分析。在Figure 5 a 中，展示了 PC-3 细胞染色结果。本研究进行的流式细胞术结果表明，在未经处理的对照组细胞中，约 98%的细胞保持存活。这是可以预料的，因为大多数对照组细胞不会发生凋亡，因为它们既未接受 NPs 处理，也未接受草药提取物处理。早期凋亡细胞的百分比为 3%，而晚期凋亡细胞的百分比为 0%，坏死细胞的百分比极低，为 0.4%。根据草药提取物和银-铜 NPs 在 IC50 浓度下的结果，活细胞（Q4 区域）的百分比分别为 85%和 68%。早期凋亡细胞（Q3 区域）的百分比分别为 5%和 14%，晚期凋亡细胞（Q2 区域）的百分比分别约为 8%和超过 10%。 此外，在草药提取物、银和铜纳米粒子的 IC50 浓度下，坏死细胞（Q1 区域）的百分比分别为 2.5%和 8%[ Figure 5 a]。图示表明，与其它组相比，暴露于纳米粒子的细胞中早期凋亡的发生率显著更高[ Figure 5 b]。此外，暴露于纳米粒子的细胞中晚期凋亡的百分比在统计学上高于其它组。然而，可以观察到暴露于纳米粒子的细胞中早期凋亡水平高于晚期凋亡。草药提取物处理的细胞中晚期凋亡的百分比高于早期凋亡，并且所有提到的 P 值均显著（P < 0.001）。对于 LNCaP 细胞，Ag–Cu 纳米粒子处理组的早期凋亡、晚期凋亡和坏死的百分比分别为 10%、14%和 12%，而提取物处理组的百分比分别为 4.5%、8%和 4%[ Figure 5 c]。提取物处理 LNCaP 细胞的凋亡率低于 Ag–Cu 纳米粒子处理组[ Figure 5 d]。有趣的是，植物提取物对细胞系没有不同的作用，凋亡率相似。 然而，PC-3 和 LNCaP 细胞系的分布差异表明它们对 NP 治疗的不同反应。
(a) PC-3 和(c) LNCaP 细胞在 IC50 浓度 Ag–Cu NPs 处理后的凋亡率。(b, d) 提取物和 Ag–Cu NPs 在 24 小时处理后对(b) PC-3 和(d) LNCaP 细胞凋亡率和坏死率的比较。(*:P < 0.05, ****:P < 0.0001, ##:P < 0.01, ###:P < 0.001)
ROS 或活性氧是来自氧分子的高活性分子和自由基。许多研究表明，ROS 在肿瘤诱导的免疫抑制细胞的抑制行为中起着重要作用。如图Figure 6 所示，作者合成的双金属 NPs 在 24 小时暴露下比植物提取物更有效地产生 ROS。如图 Figure 6 a 和 b 所示，与对照组相比，经提取物处理 24 小时后，PC-3 和 LNCaP 细胞的 ROS 含量分别提高了约 1.5 倍和 1.6 倍；而经 Ag–Cu NPs 处理 24 小时后，ROS 含量分别提高了约 2.3 倍和 2.4 倍。
(a)PC-3 细胞系和(b) LNCaP 细胞系在用 IC50 浓度的提取物和 Ag–Cu 纳米颗粒处理 24 小时后的 ROS 水平 (*:P < 0.05, 和, ***:P < 0.001)。
总结
Ag–Cu 纳米粒子通过利用E. billardieri 植物的叶水提物，采用一种自然无害的方法有效制备，并考虑其对 PC-3 和 LNCaP 前列腺癌细胞系的抗癌作用。XRD、SEM、EDAX、FTIR 和 SEM 等表征方法证实了纳米粒子的制备。此外，Ag-Cu 纳米粒子的抗癌效果在人类前列腺 PC-3 和 LNCaP 细胞上得到检验，表明其作为凋亡诱导剂和抗转移纳米复合材料的特性。似乎 ROS 水平的增加导致了这一现象。。
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