大家好，今天跟大家分享一篇题为WTAP Mediated m6A Modifcation Stabilizes PDlA3Pi andPromotes Tumor Progression Driven by Histone Lactylationin Esophageal Squamous Cell Carcinoma（WTAP介导的m6A修饰稳定PDlA3Pi并促进食管鳞状细胞癌中组蛋白乳糖酶化驱动的肿瘤进展）研究发现lncRNA“PDIA3P1”在ESCC组织及细胞系中高表达，RNA-seq结果揭示其与糖酵解相关。
01
研究背景
食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种常见的消化道恶性癌症，发病率和死亡率都很高。许多研究表明，长链非编码 RNA（lncRNA 参与各种类型肿瘤的进展。lncRNA蛋白二硫键异构酶家族A成员3假基因1（PDIA3P1）促进食管鳞癌的进展，但其背后的分子机制尚不清楚。在这项研究中，PDIA3P1在ESCC中高表达，通过调节糖酵解产生更多的乳酸，增加的乳酸上调乳酸水平以驱动肿瘤进展。
在机制上，PDIA3P1与miR-152-3p竞争，阻止葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）mRNA的降解，并破坏膜相关RING-CH 8（MARCH8）和己糖激酶2（HK2）之间的结合，减少HK2的泛素化降解，从而促进糖酵解。高活性糖酵解产生更多的乳酸，从而上调组蛋白 H4K8 乳酸化 （H4K8la） 的水平并促进靶骨形态发生蛋白 7 （BMP7） 的转录。在功能上，BMP7 在体内和体外都通过PDIA3P1参与 ESCC 进展的调节。
此外，wilms 肿瘤 1 相关蛋白 （WTAP） 介导的 m6A 修饰通过胰岛素样生长因子 2 mRNA 结合蛋白 1 （IGF2BP1） 依赖性识别增强PDIA3P1的稳定性。综上所述，这些发现揭示了PDIA3P1调节糖酵解-H4K8la-BMP7轴在食管鳞癌进展中的关键作用，并为代谢重编程和表观遗传调控之间的相互作用提供了新的见解。
见图一PDIA3P1是食管鳞状细胞癌糖酵解的促进剂。
图一
A） 通过RNA-seq对shPDIA3P1与shNC差异基因的KEGG代谢分析。
B，C）2-NBDG摄取通过流式细胞术检测，以监测转染PDIA3P1-siRNA（B）或PDIA3P1表达质粒（C）细胞的葡萄糖摄取（MFI：平均荧光强度）。
D，E）在沉默PDIA3P1（D）或过表达PDIA3P1细胞（E）中测量乳酸产量。
F，G）检测敲低PDIA3P1细胞（F）或过表达PDIA3P1细胞（G）中的葡萄糖摄取。
H，I） 海马对 ECAR、糖PER（糖酵解质子外排率）、PDIA3P1敲低细胞 （H） 或 PDIA3P1 过表达细胞 （I） 中的基础糖酵解和代偿性糖酵解的代谢分析（Rot/AA：鱼藤酮/抗霉素 A;2-DG：2-脱氧-D-葡萄糖）。
J，K）在沉默的PDIA3P1细胞（J）或过表达PDIA3P1细胞（K）中测定乙酰辅酶A的相对水平。
L，M）检测敲低PDIA3P1细胞（L）或过表达PDIA3P1细胞（M）中的相对α-酮戊二酸水平。这些数据代表一式三份的平均值±标准差。
见图二
糖酵解介导食管鳞状细胞癌进展的PDIA3P1调节。
图二
A） 糖酵解和抑制方法目标示意图。
B-G） 用外源性乳酸 （15mm） 处理 TE-1 和 Eca-109 细胞中 PDIA3P1 的稳定沉默 24 小时。B） 通过 CCK-8 测定研究增殖能力。C） 使用集落形成测定分析 ESCC 细胞生长。上图用于统计分析。D） 进行 EdU 测定以评估 ESCC 细胞的增殖能力。上图用于统计分析。比例尺：100μm。E）膜联蛋白V-APC / 7-AAD染色，用于通过流式细胞术检测TE-1和Eca-109细胞中的细胞凋亡。右侧面板用于统计分析。
F） Transwell测定法检测细胞迁移和侵袭的变化。上图用于统计分析。Transwell 比例尺：10 μm。G） 蛋白质印迹显示 E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和蜗牛的表达水平。这些数据代表一式三份的平均值±标准差。
见图三
PDIA3P1上调GLUT1和HK2，促进ESCC细胞的糖酵解。
图三
A，B）在TE-1和Eca-109细胞中稳定沉默后（A）或在KYSE-30和KYSE-150细胞中稳定过表达后PDIA3P1 PDIA3P1 GLUT1、HK2、PFKFB3、PKM2和LDHA的蛋白质印迹分析（B）。
C，E，G，I）在PDIA3P1稳定敲低的Eca-109细胞中，分别转染GLUT1和HK2的过表达质粒。D，F，H，J）在稳定过表达PDIA3P1的KYSE-150细胞中，分别转染GLUT1 siRNA和HK2 siRNA。C，D）流式细胞术检测的相对2-NBDG摄取（MFI：平均荧光强度）。E，F）使用乳酸测定试剂盒测量相对乳酸产量。G，H）检测ESCC中的相对葡萄糖摄取。
I，J）将细胞进行海马代谢分析仪，以确定糖酵解速率，包括ECAR，糖PER，基础糖酵解速率和代偿性糖酵解速率。这些数据代表一式三份的平均值±SD。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001。
见图四
PDIA3P1充当miR-152-3p的海绵来调节GLUT1的表达。
图四
A，B）qRT-PCR分析稳定的PDIA3P1-KD细胞（A）或稳定的PDIA3P1-OE细胞（B）中GLUT1 mRNA水平。
C）对AGO2进行RIP测定，检测AGO2IP沉淀中内源性PDIA3P1水平。
D）通过miRNet和ENCORI预测PDIA3P1海绵状的miRNA，miRNet、TargetScan、miRDB和ENCORI预测靶向GLUT1的miRNA，交集预测5个miRNA。
E，F） AGO2-RIP 测定显示预测的 5 个 miRNA 在稳定的 PDIA3P1-KD 细胞 （E） 或稳定的 PDIA3P1-OE 细胞 （F） 中富集。
G） PDIA3P1 和 miR-152-3p 之间的假定结合序列。
H） 通过双荧光素酶报告基因测定检测与野生型或突变型 lncRNA PDIA3P1 和 miR-152-3p 模拟物或对照物共转染的 TE-1 和 Eca-109 细胞。
I） 将含有 WT 或 MUT PDIA3P1 转录本的荧光素酶报告基因与 miR-152-3p 抑制剂或 miR 对照共转染在 KYSE-30 和 KYSE-150 细胞中。
J） FISH 结果显示 PDIA3P1 和 miR-152-3p 在 Eca-109 细胞细胞质中的共定位。
K） 生物素-miR-152-3p 或生物素-miR-对照下拉的PDIA3P1富集。
L） miR-152-3p 在 GLUT1 的 3′-UTR 中的假定结合序列。M） 通过双荧光素酶报告基因测定检测与 GLUT1 的野生型或突变体 3′-UTR 和 miR-135b-3p 模拟物或对照共转染的 ESCC 细胞。
N） 将含有 GLUT1 的 WT 或 MUT 3′-UTR 的荧光素酶报告基因与 miR-152-3p 抑制剂或 miR 对照共转染在 ESCC 细胞中。
O）将miR-152-3p抑制剂转染到稳定的PDIA3P1-KD细胞中，qRT-PCR检测GLUT1的表达水平。
P）将miR-152-3p模拟物转染到稳定的PDIA3P1-OE细胞中，qRT-PCR检测GLUT1的表达水平。
Q，R）将miR-152-3p抑制剂转染到稳定的PDIA3P1-KD细胞（Q）或miR-152-3p模拟物中稳定的PDIA3P1-OE细胞（R），Western blot检测GLUT1的表达水平。这些数据代表一式三份的平均±S.D.。
见图五
PDIA3P1通过MARCH8介导的泛素-蛋白酶体途径抑制HK2降解。
图五
A、B）稳定的PDIA3P1-KD细胞（A）或稳定的PDIA3P1-OE细胞（B）中HK2 mRNA水平的qRT-PCR分析。
C）敲低PDIA3P1时使用CHX（200μg/mL）对HK2蛋白稳定性进行蛋白质印迹分析。
D）在PDIA3P1-KD细胞中用MG132（10μM）或CQ（20μM）处理后HK2的蛋白质印迹分析表达。
E）在稳定沉PDIA3P1的细胞中通过蛋白质印迹检测HK2的泛素化水平。IgG用作阴性对照。
F）将PDIA3P1-KD细胞与Flag抗体共免疫沉淀，检测免疫复合物中K48连接的泛素和K63连接的泛素的表达。
G）PDIA3P1下拉，然后Western blot验证了其与HK2的相互作用。
H）将Flag-HK2质粒转染到细胞中，在KYSE-150和Eca-109细胞中使用HK2抗体进行RIP测定。
I）FISH和IF分析显示PDIA3P1和HK2在细胞质中的共定位。
J）分别敲低细胞中的SYVN1、MARCH1、MARCH8、MDM2和CBL-b后，Western blot检测HK2的表达。
K） 通过 Co-IP 测定验证胃癌细胞中 SYVN1 或 MARCH8 和 HK2 之间的相互作用。
L） IF 分析显示 MARCH8 和 HK2 在细胞质中的共定位。M） 将 Flag-HK2 质粒转染到细胞中，与抗 Flag 抗体共 IP 检测 MARCH8 和 HK2 在 PDIA3P1-KD 细胞中的相互作用。
N） 将 MARCH8 cDNA 质粒转染到 PDIA3P1-OE 细胞中，并通过蛋白质印迹检测 HK2 表达。这些数据代表一式三份的平均± SD。
见图六
PDIA3P1通过促进 ESCC 细胞中的糖酵解来增加 H4K8la 水平。
图六
A） 蛋白质印迹显示正常细胞系 HEEC 和 5 种 ESCC 细胞系（KYSE-30、KYSE-150、KYSE-520、TE-1 和 Eca-109）中 Pan Kla 的水平。
B，C）在TE-1和Eca-109细胞中PDIA3P1稳定沉默后（B）PDIA3P1或在KYSE-30和KYSE-150细胞中稳定过表达（C）后Pan-Kla的蛋白质印迹分析。
D，E）IF染色的代表性图像揭示了Eca-109（D）中的PDIA3P1敲低或KYSE-150（E）中过表达的PDIA3P1对Pan-Kla表达的影响。
F，G）PDIA3P1-KD细胞（F）或PDIA3P1-OE细胞（G）中位点特异性组蛋白乳酸化的蛋白质印迹分析。
H，I）IF染色的代表性图像揭示了Eca-109（H）中的PDIA3P1敲低或KYSE-150（I）中过表达的PDIA3P1对H4K8la表达的影响。
J）乳酸处理PDIA3P1-KD细胞24 h，Western blot测定H4K8乳酸化水平。在2-DG或草酰胺中培养24 h的PDIA3P1-OE细胞中，通过蛋白质印迹检测到K）H4K18la水平。
02
研究结论
综上所述，本研究阐明糖酵解和组蛋白乳酸化介导PDIA3P1对ESCC进展的调节作用。同时，m6A修饰参与PDIA3P1的稳定性调控。这项工作提出了一种由lncRNA调控的ESCC进展的新型分子机制，为ESCC治疗提供了新的有前途的分子靶点和潜在的治疗策略。
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