为了全面研究 Vin 在黑色素瘤进展中的作用，作者进行了体外和体内实验，以评估其对细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长的影响。Vin 是一种生物碱，含有从 Catharanthus 属植物中提取的苯环（图 1A）。它在临床上被广泛用于治疗缺血性脑卒中和其他脑血管疾病。CCK-8 测定表明，Vin 以剂量和时间依赖性方式显着降低了人黑色素瘤细胞系 A375、SK-MEL-28、SK-MEL-5 和小鼠黑色素瘤细胞系 B16F10 的活力，A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 的 IC50 值约为 5 μM，B16F10 的 IC50 值约为 7.5 μM。CCK-8 测定表明，Vin 以剂量和时间依赖性方式显着降低了人黑色素瘤细胞系 SK-MEL-5、SK-MEL-28、A375 和小鼠黑色素瘤细胞系 B16F10 的活力，SK-MEL-5、SK-MEL-28 和 A375 的 IC50 值约为 5 μM，B16F10 的 IC 50 值约为 7.5μM（图 1B，支持信息图 S1A）。相比之下，Vin 即使在 20 μM 的高浓度下也不会对正常人黑色素细胞 （PIG1） 表现出细胞毒性作用（图 S1B）。集落形成测定进一步证实，Vin 剂量依赖性地抑制 SK-MEL-28、A375、SK-MEL-5 和 B16F10 细胞的集落形成能力 （ 图 1C-D）。流式细胞术评估细胞周期分布，以进一步探讨 Vin 对细胞增殖的影响。数据显示，Vin 处理显着阻止了黑色素瘤细胞的 G0 / G1 期（图 1 C-D）。此外，伤口愈合（图 2A-C）和 Transwell 侵袭测定（图 1 C-D）。 S2D-F）显示 Vin 显著抑制 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞的迁移和侵袭。这些体外研究结果表明，Vin 能有效抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，促使进一步研究其体内抗肿瘤功效。为此，将 B16F10 黑色素瘤细胞皮下接种到 C57BL/6 小鼠体内，并监测肿瘤生长情况（图 1 E）。与载体对照组相比，Vin 治疗（10 和 20 mg/kg）显著抑制了 B16F10 荷瘤小鼠的肿瘤生长（图 1 F-G）。值得注意的是，在 Vin 治疗期间，体重没有观察到显着变化（图 1H），表明 Vin 在体内发挥了有效的抗肿瘤作用，而不会引起明显的全身毒性。为了评估 Vin（10 mg / kg）对 TME 的影响，作者使用流式细胞术分析了肿瘤组织内的免疫细胞浸润。与对照组相比，Vin 处理显着增强了肿瘤中 CD8⁺ T 细胞、CD4⁺T 细胞和 NK 细胞的浸润（图 1 I-J）。此外，在用 Vin 处理的肿瘤组织中，作者观察到调节性 T 细胞（Treg）和 M2 巨噬细胞的浸润略有减少，而 M1 巨噬细胞浸润略有增加;然而，这些差异没有统计学意义（图 1J，图 S3A-B）。总之，这些结果表明 Vin 不仅可以抑制肿瘤生长，还可以通过重塑 TME 的免疫景观来增强抗肿瘤免疫力。
Vin 抑制黑色素瘤进展。A 长春笋的化学结构。B 在用 Vin 处理后 24、48 和 72 小时通过 CCK-8 测定评估黑色素瘤细胞（SK-MEL-5、SK-MEL-28、A375 和 B16F10）的增殖。n = 6。根据单因素方差分析，数据以均值 ± SD、P < 0.001 表示。用 2.5 和 5 μM 的 Vin 处理 48 小时的 SK-MEL-5、SK-MEL-28 和 A375 细胞的 C、D 集落形成测定。用 5 和 10 μM 的 Vin 处理 48 小时的 B16F10 细胞的集落形成测定。根据单因素方差分析，数据以 SD、ns.、不显着、**P < 0.01、P < 0.001 ±均值表示。E 动物治疗实验设计的示意图。F，H 用载体或 Vin（ 10mg / kg 和 20mg / kg）治疗的小鼠的肿瘤外观，肿瘤体积和体重。n = 6。根据单因素方差分析，数据以平均值表示±SD，*p < 0.05，**p < 0.01。I CD8 + T 细胞的代表性流式细胞术门控策略和 CD8 + T 细胞的定量。J 荷瘤小鼠中 CD4+ T 细胞、NK 细胞、Treg 细胞、M1 巨噬细胞和 M2 巨噬细胞的流式细胞术定量。n = 5。根据配对 t 检验，数据以 SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01 ±均值表示。Treg：调节性 T 细胞，M1：M1 型巨噬细胞，M2：M2 型巨噬细胞
Vin 诱导黑色素瘤细胞中的 ROS 过度产生、DNA 损伤和细胞灭亡
为了探讨 Vin 的抗黑色素瘤作用是否是由 ROS 积累介导的，作者首先使用流式细胞术测量了 Vin 治疗后黑色素瘤细胞中的细胞内 ROS 水平。如图所示。 阿拉伯数字A-B，Vin 显着提高了 ROS 的产生。为了验证 ROS 积累的功能意义，作者用 Vin 和 ROS 清除剂 NAC 共同处理细胞。NAC 有效地逆转了 Vin 诱导的黑色素瘤细胞生长抑制（图。S4A），表明 ROS 的产生是 Vin 抗肿瘤活性的关键介质。鉴于已知 ROS 水平升高会诱导氧化 DNA 损伤并破坏基因组完整性[27]，作者接下来检查了 Vin 是否会引起 DNA 损伤。彗星测定显示，与对照组相比，尾长、尾部 DNA 含量和尾矩增加，Vin 处理的细胞中出现明显的 DNA 链断裂，这证明了这一点（图 2C-F）。为了进一步探索 DNA 损伤反应 （DDR） 通路被激活，作者分析了包括 p-ATM、p-ATR 和 γH2AX 在内的典型 DDR 标记物。蛋白质印迹分析显示，在 Vin 暴露后，这些蛋白质在 A375、SK-MEL-28、SK-MEL-5 和 B16F10 细胞中出现了强劲的上调[图 2G-H，图 2 G-H，图 2 C-F。S4B-C）。一致地，免疫荧光染色显示，在 A375 和 SK-MEL-28 细胞中，Vin 处理后γH2AX 阳性细胞显着增加（图。S4D-E）。由于 ROS 诱导的 DNA 损伤通常与细胞灭亡相结合[28]，作者接下来评估了对 Vin 的反应细胞死亡。流式细胞术显示，在 Vin 处理的细胞中，早期细胞死亡群体显着增加（图。S4F-G）。在分子水平上，Vin 增加了促凋亡蛋白的表达，如 BAX、裂解的 caspase-3 和 cleaved caspase-9，同时下调了抗凋亡因子 BCL-2（图 2I-J）。总之，这些结果表明 Vin 通过诱导氧化应激来发挥其抗肿瘤作用，导致黑色素瘤细胞的 DNA 损伤、DDR 激活和凋亡。
Vin 对黑色素瘤细胞中 ROS 生成、DNA 损伤和细胞灭亡的影响。A、B 流式细胞术分析用 2.5 和 5 μM 的 Vin 处理 375 和 5 μM 的 Vin 处理 6 小时的 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中 ROS 水平。根据单因素方 差分析，数据以 SD ±平均值表示，***p < 0.001。C 彗星测定评估用 2.5 和 5 μM Vin 处理 24 小时的 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中的 DNA 损伤。根据双向方差分析，数据以平均值表示± SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001。彗星测定数据的量化，包括尾部 DNA （D）、 尾部长度 （E） 和尾矩 （F）。n = 3。根据单因素方差分析，数据以均值± SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 表示。用 2.5 和 5 μM Vin 处理 24 小时的 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中 DNA 损伤标记物、p-ATM、p-ATR 和 γH2AX 的 G、H Western 印迹分析。根据单因素方差分析，数据以平均值± SD、ns.、不显着、p < 0.001 表示。I，J 用 2.5 和 5 μM Vin 处理 48 小时的 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中细胞凋亡标志物、BCL2、BAX、裂解半胱天冬酶 3 和半胱天冬酶 9 的蛋白质印迹分析。根据单因素方差分析，数据以平均值± SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 表示
Vin 显着上调黑色素瘤细胞中 IL-24 的表达
为了进一步研究 Vin 对黑色素瘤细胞生长的抑制作用的潜在机制，作者对 A375 细胞进行了转录组学分析，比较了高剂量、低剂量和溶剂对照组的基因表达谱。结果显示，低剂量组有 818 个上调基因和 1177 个下调基因，高剂量组有 2702 个上调基因和 3122 个下调基因，两个治疗组共有 1846 个差异表达基因（DEGs）（图。S5KEGG 通路富集分析显示，Vin 处理显著影响多个信号通路。在高剂量组中，与细胞周期、DNA 复制和细胞灭亡相关的通路明显富集 （ 图 3 A）。 值得注意的是，MAPK 信号传导也是富集的通路之一。与这一发现一致，蛋白质印迹分析表明，Vin 选择性地增强了 P38 的磷酸化，对 p-JNK 和 p-ERK 的影响可以忽略不计，表明 P38 / MAPK 轴优先激活（图 3 B-C，图。S5D-E）。鉴于作者之前的发现，Vin 治疗增强了肿瘤微环境中的 CD8⁺ T 细胞浸润，作者随后询问了转录组学数据，以确定可能有助于 T 细胞介导的细胞毒性的差异表达细胞因子。 火山图分析表明，Vin 处理显著上调了 IL-24、IL-12 A、IL-32、TNC 和 EBI3（图 3 D）。RT-PCR 验证证实，IL-24 表达以时间和剂量依赖性方式增加，在 A375，SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中观察到最显着的变化（图 3 E）。此外，用 10μM Vin 处理导致 B16F10 细胞中 IL-24 mRNA 水平显着增加（图 3 E）。S5 为了进一步评估 IL-24 蛋白的表达，作者对 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞的培养上清液进行了 ELISA 和 Western blot 分析，结果一致表明 Vin 处理显著增强了 IL-24 的分泌（图 3 F）。对于 B16F10 细胞，通过蛋白质印迹评估上清液中 IL-24 蛋白的表达，并在 Vin 处理后显示出类似的增加（图。S5G）。这些发现表明，IL-24 是有助于 Vin 抗黑色素瘤作用的关键效应分子。
黑色素瘤细胞中 Vin 治疗的分子谱和功能验证。差异表达基因的 KEGG 通路富集分析。B，C 用 2.5 或 5μM 的 Vin 处理黑色素瘤细胞中 MAPK 信号通路标志物和转录因子 ATF3 表达的蛋白质印迹分析，持续 48 小时。根据单因素方差分析，数据以均值± SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 表示。D RNA 测序中 DEG 的火山图，突出显示了细胞因子和 ATF3。E 基于 RNA 测序数据对 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中差异表达细胞因子（IL24、IL12A、EBI3、TNC、ATF3）进行 RT-PCR 验证。n = 3。根据单因素方差分析，数据以均值± SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 表示。F ELISA 和蛋白质印迹测量用 2.5 或 5 μM Vin 处理 48 小时的 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞的条件培养基中 IL-24 水平。 根据单因素方差分析，数据以均值 ± SD、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 表示。通过敲低 ATF3 敲低的 A375 和 SK-MEL-28 细胞中 ATF3 和 IL-24 mRNA 表达的 G RT-PCR 分析。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值 ± SD、p < 0.001 表示。Ctrl：对照，IL-24：白细胞介素 24、IL-12 A、白细胞介素 12 A、IL-32、白细胞介素 32、EBI3：EB 病毒诱导 3、TNC：凝血反应蛋白 1、ATF3：激活转录因子 3
为了探索导致 Vin 诱导的 IL-24 上调的潜在调节因素，作者重点关注 ATF3，这是参与细胞应激反应的 P38/MAPK 通路的下游效应子[29]。作者的 RNA-seq 数据显示，Vin 处理后 ATF3 表达显着增加（图 3 D）。蛋白质印迹和 RT-PCR 进一步验证了这一发现，结果显示 ATF3 在 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中具有很强的诱导作用[图 3 B-C，E]。同样，Vin 处理也增加了 B16F10 细胞中的 ATF3 mRNA 和蛋白质水平（图 3S5D-F）。重要的是，RT-PCR 分析显示，ATF3 敲低显著降低了 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中的 IL-24 mRNA 水平（图 3G），表明 ATF3 是 Vin 诱导的 IL-24 转录所必需的。总之，这些结果表明 ATF3 可能作为将 P38 激活与 IL-24 上调联系起来的关键转录调节因子，从而有助于 Vin 的抗黑色素瘤作用。
Vin 通过 P38/MAPK/ATF3 通路上调 IL-24 表达，增强体内抗肿瘤免疫
为了确定 Vin 是否通过 P38/MAPK/ATF3 信号通路上调 IL-24 表达，作者用 P38 抑制剂 SB203580 与 Vin 联合处理黑色素瘤细胞。结果表明，SB203580 有效抑制了 Vin 诱导的 ATF3 和 IL-24 mRNA 和蛋白质水平[ 图 4 A-C》，表明 P38/MAPK 通路的激活对于上调 ATF3 和 IL-24 至关重要。此外，敲低 A375、SK-MEL-28 和 B16F10 细胞中 ATF3 显着减弱了 Vin 诱导的 IL-24 表达增加（图 4E-F、图 S5I-J），支持 ATF3 在介导 IL-24 转录中的调节作用。为了进一步研究 ATF3 是否直接调节 IL-24 表达，作者构建了含有 IL-24 启动子区域的双荧光素酶报告质粒，并进行了荧光素酶测定。结果表明，ATF3 直接与 IL-24 启动子区域结合，Vin 处理增强了这种结合（图 4G）。ChIP 测定证实了 ATF3 和 IL-24 启动子之间的相互作用（图 4H-I）。总之，这些发现揭示了一种新的分子机制，Vin 通过激活 P38/MAPK/ATF3 信号通路上调 IL-24 表达。
Vin 通过 P38/MAPK/ATF3 调节黑色素瘤细胞中 IL-24 的表达。A、B 用 Vin （5 μM） 和 P38 抑制剂 SB203580 （P38i，10 μM） 处理的 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中 ATF3 和 IL-24 蛋白表达的蛋白质印迹分析。n = 3。根据单因素方差分析，数据以均值 ± SD、ns.、不显着、**p < 0.01、p < 0.001 表示。用 Vin 和 P38i 处理的 A375、SK-MEL-28 和 SK-MEL-5 细胞中 ATF3 和 IL-24 mRNA 水平的 C RT-PCR 分析。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值 ± SD、*p < 0.05、p < 0.001 表示。用 Vin （5μM） 处理的 ATF3 敲低黑色素瘤细胞中 ATF3 和 IL-24 mRNA 水平的 D RT-PCR 分析。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值 ± SD、*p < 0.05、p < 0.001 表示。E、F 用 Vin （5μM） 处理的 ATF3 敲低黑色素瘤细胞中 ATF3 和 IL-24 蛋白水平的蛋白质印迹分析。n = 3。根据单因素方差分析，数据以均值 ± SD，ns.，不显着，p < 0.001 表示。G 双荧光素酶报告基因测定显示 ATF3 在 Vin 处理后与 IL-24 启动子结合。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值 ± SD、*p < 0.05、p < 0.001 表示。H 靶向 IL-24 启动子的 ChIP 引物示意图。I ChIP 分析显示 ATF3 与 SK-MEL-28 细胞中的 IL-24 启动子结合。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值±标准差、ns.、不显著、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 表示。 IL-24：白细胞介素 24、ATF3：激活转录因子 3、p38i、p38 抑制剂
为了验证 P38/MAPK/ATF3/IL-24 轴在体内的功能意义，作者建立了具有 ATF3 或 IL-24 稳定敲低的黑色素瘤异种移植模型。蛋白质印迹分析证实，在植入前有效敲低肿瘤细胞中的 ATF3 和 IL-24（图。S6A）. 在 Vin 处理后，对照肿瘤表现出显着的生长抑制，而 ATF3 或 IL-24 敲低的肿瘤对 Vin 的敏感性显着降低，观察到的肿瘤生长抑制最小（图。S6B-C）。在治疗期间，各组之间的小鼠体重没有显着差异（图。S6 此外，对肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术分析显示，在 ATF3 和 IL-24 缺陷的肿瘤中，Vin 诱导的 CD8⁺ T 细胞浸润增加，以及 GZMB⁺和 IFNγ⁺ CD8⁺ T 细胞的比例均被消除（图。S6E）. 这些结果表明，ATF3-IL-24 轴对于 Vin 介导的体内抗肿瘤免疫增强和肿瘤生长抑制至关重要。
Vin 通过 IL-24/IL-20R2 信号轴增强 T 细胞介导的细胞毒性
基于先前的体内观察表明 CD8⁺ T 细胞在 Vin 诱导的抗肿瘤免疫中起关键作用，作者建立了体外共培养系统，以探索 Vin 如何激活 CD8⁺ T 细胞介导抗肿瘤免疫反应。从健康供体和小鼠脾脏中分离出 PBMC，然后在 Vin 存在下与表达荧光素酶的黑色素瘤细胞共培养，以评估 PBMC 对黑色素瘤细胞的细胞毒性作用。使用荧光素酶报告系统，作者测量了涉及 Vin、PBMC 和黑色素瘤细胞的联合治疗模型中的黑色素瘤细胞活性（图 1）。5 结果表明，Vin 以剂量依赖性方式显着增强 PBMC 介导的对 SK-MEL-28 和 A375 细胞的细胞毒性（图 5 B）。当 PBMC 在与黑色素瘤细胞共孵育之前用 Vin 预处理时，与对照组相比，PBMC 介导的细胞毒性没有增加（图 5 C）。这些发现表明，Vin 作用于黑色素瘤细胞以诱导免疫调节因子的分泌，而不是直接增强 T 细胞功能。为了进一步研究 Vin 对免疫细胞介导的细胞毒性的影响，作者采用了涉及小鼠来源的 PBMC、B16F10 细胞和 Vin 的共培养模型。与人黑色素瘤细胞的结果类似，Vin 处理显著增强了 PBMC 介导的 B16F10 细胞杀伤（图 5 D）。作者进一步使用磁珠分选分离并激活 CD8⁺ T 细胞小鼠脾脏，并将它们与 B16F10 细胞共培养。与 PBMC 结果一致，Vin 显着增强了 CD8⁺ T 细胞对 B16F10 细胞的细胞毒性活性（图 5 E，图 7S7 A). 接下来，作者使用流式细胞术和 RT-PCR 检查了共培养系统内 CD8⁺ T 细胞和 Jurkat 细胞功能标志物的变化。流式细胞术分析显示，在活化状态下，与 Vin 处理的黑色素瘤细胞共培养的 PBMC 中 IFNγ+CD8⁺ T 细胞和 GZMB+CD8⁺ T 细胞的比例显着增加（图 5 F）。 此外，RT-PCR 分析表明，与 Vin 处理的黑色素瘤细胞共培养的 Jurkat 细胞在激活状态下表现出明显更高的 IFNγ、GZMB、IL-2 和 TNFαmRNA 水平。IL-2 和 TNFα的上调证实了 Jurkat 细胞的成功激活（图 5 G）。为了进一步探索 IL-24 在此过程中的作用，作者从 Vin 处理或未处理的黑色素瘤细胞中收集条件培养基（CM），并将其用于处理 Jurkat 细胞。结果表明，在激活状态下，来自 Vin 处理的黑色素瘤细胞的 CM 同样增强了 Jurkat 细胞中 IFNγ，GZMB，IL-2 和 TNFα的表达（图。S7 鉴于 Vin 处理的黑色素瘤细胞分泌增加的 IL-24，作者假设 Vin 通过黑色素瘤细胞分泌 IL-24 来增强 CD8⁺ T 细胞功能。为了验证这一假设，作者用重组 IL-24（rIL-24）蛋白刺激 PBMC 和 Jurkat 细胞，并使用流式细胞术和 RT-PCR 分析功能标志物。结果表明，rIL-24 处理显著增加了 PBMCs 中 IFNγ+CD8⁺ T 细胞和 GZMB+CD8⁺ T 细胞的比例（图 5H），并增强了 Jurkat 细胞中 IFNγ、GZMB、IL-2 和 TNFα的表达（图 5I）。
Vin 通过促进黑色素瘤中 IL-24 的分泌来增强 CD8+ T 细胞的细胞毒性。A PBMC 的人血样和小鼠脾脏组织分离的示意图，用于后续测定。B 基于荧光素酶的细胞毒性测定，对 Vin 处理的 Luci-人黑色素瘤细胞进行细胞毒性测定，这些细胞与或不与 2.5× H-PBMC 共培养 12 小时。 根据双向方差分析，数据以均值表示为 SD、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 ±均值。C PBMC 的细胞毒性测定用 Vin 预处理 24 小时，然后与 luci-A375 细胞以 2.5：1 的比例共培养 12 小时，通过荧光素酶检测测量。n = 3。数据以均值 ± SD、ns. 表示，根据配对 t 检验不显着。D 基于荧光素酶的细胞毒性测定，对 Vin 处理的 luci-B16F10 细胞进行有或没有 5× M-PBMCs 共处理 24 小时。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值±SD，p < 0.001 表示。E 通过荧光素酶测定检测，与或不与 2.5×活化 CD8 + T 细胞共培养 12 小时的 Vin 处理的 luci-B16F10 细胞的细胞毒性测定。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值表示± SD、**p < 0.01、p < 0.001。F 共培养设置：上腔包含有或没有 Vin 处理的肿瘤细胞，下腔包含有或没有激活的 H-PBMC。来自共培养系统下腔的 CD8+ T 细胞中功能标志物（GZMB 和 IFNγ）的流式细胞术分析。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值 ± SD、ns.、不显着、p < 0.001 表示。 G 共培养设置：上腔包含有或没有 Vin 处理的肿瘤细胞，下腔包含有或没有激活的 Jurkat 细胞。来自共培养系统的 Jurkat 细胞中 IFNγ、GZMB、IL-2 和 TNF-α 表达的 RT-PCR 分析。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值表示为 SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 ±均值。H 流式细胞术分析用 rIL-24 处理的 H-PBMC 的 CD8+ T 细胞中 GZMB 和 IFNγ。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值± SD、ns.、不显着、**p < 0.01、p < 0.001 表示。I 用 rIL-24 处理的 Jurkat 细胞中 IFNγ、GZMB、IL-2 和 TNF-α 表达的 RT-PCR 分析。n = 3。根据双因素方差分析，数据以均值± SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 表示。J 使用 Vin 处理的 Luci-A375 细胞的细胞毒性测定，使用 （A） 中描述的共培养系统进行。将细胞与含有或不含抗 IL-20R2 的 H-PBMC 共培养 12 小时。 根据双向方差分析，数据以均值± SD、**p < 0.01、p < 0.001 表示。K 用 Vin 处理的 Luci-B16F10 细胞的细胞毒性测定，使用 （A） 中描述的共培养系统进行。与 CD8+ 共培养或不联合抗 IL-20R2 的细胞 24 小时。n = 3。根据双向方差分析，数据以平均值± SD、p < 0.001 表示。 L Transwell 共培养系统的示意图：将 Vin 处理的 A375 细胞接种在上腔室中，而将处理有或没有抗 IL-20R2 处理的 Jurkat 细胞置于下腔室中。来自 Transwell 共培养系统下腔的 Jurkat 细胞中 IFNγ，GZMB，IL-2 和 TNF-α表达的 M RT-PCR 分析（L）。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值表示为 SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 ±均值。N 使用两个慢速病毒序列 IL-20R2 敲低 Jurkat 细胞，并通过 RT-PCR 检测 mRNA 水平。n = 3。根据双向方差分析，数据以均值± SD、ns.、不显着、*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001 表示。O Transwell 共培养系统的示意图：将 Vin 处理的 A375 细胞接种在上室中，而将 IL-20R2 敲低的 Jurkat 细胞放置在下室中。 来自 Transwell 共培养系统 （O） 下室的 Jurkat 细胞中 IFNγ，GZMB，IL-2 和 TNF-α表达的 P RT-PCR 分析。n = 3。根据双向方差分析，数据以平均值± SD，p < 0.001 表示。PBMC：外周血单核细胞，PMA：佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯，rIL-24：重组白细胞介素 24
为了进一步研究 Vin 调节 CD8⁺ T 细胞介导的抗肿瘤免疫的机制，作者干预了 IL-24/IL-20R2 信号通路，以评估其是否在 Vin 诱导的作用中起关键作用。首先，作者在共培养系统中加入抗 IL-20R2 抗体（抗 IL-20R2）或同种型对照 IgG，以评估抗 IL-20R2 是否影响 Vin 诱导的 T 细胞介导的细胞毒性增强。结果表明，与同种型 IgG 对照相比，抗 IL-20R2 显著降低了 PBMC 对 A375 细胞和 CD8⁺ T 细胞对 B16F10 细胞的增强细胞毒性，均由 Vin 诱导（图。5J-K）。此外，抗 IL-20R2 处理降低了与 Vin 处理的黑色素瘤细胞共培养的 Jurkat 细胞中 IFNγ、GZMB、IL-2 和 TNFα的表达（图 5 L-M）。接下来，作者使用流动分选建立稳定的 IL-20R2 敲低 Jurkat 细胞，然后将其与 Vin 处理的黑色素瘤细胞共培养[图 5N，图 7C）. 敲低 IL-20R2 显着抑制了通过共培养和 Vin 处理激活的 Jurkat 细胞中 IFNγ、GZMB、IL-2 和 TNFα的上调（图 5 O-P）。此外，作者构建了 IL-24 沉默的 luci-A375 细胞，并将它们与 Vin 和 PBMC 共同孵育，以评估 PBMC 介导的对 IL-24 沉默黑色素瘤细胞的细胞毒性。结果表明，沉默 IL-24 显着逆转了 Vin 联合 PBMC 对 A375 细胞的抑制作用（图。S7D-F）。此外，流式细胞术分析显示，在共培养系统中，IL-24 沉默的 A375 组中 IFNγ+CD8+ T 细胞和 GZMB+CD8+ T 细胞的比例显着降低（图。S7 G). 总之，这些发现证实 Vin 促进黑色素瘤细胞分泌 IL-24，激活 IL-20R2 信号轴以增强 CD8⁺ T 细胞细胞毒性并增强抗肿瘤免疫反应。这些结果为了解 Vin 抗肿瘤作用的潜在机制提供了新的见解，并强调了 IL-24/IL-20R2 信号轴作为免疫治疗的有前途的靶点。
Vin 联合 PD-1 阻断剂有效抑制体内黑色素瘤生长
将免疫检查点抑制剂与其他治疗方法相结合有望改善黑色素瘤治疗结果。为了评估 Vin 与免疫检查点抑制剂联合使用的治疗潜力，作者研究了抗 PD-1 抗体联合 Vin 在 B16F10 小鼠肿瘤模型中的作用（图 6 结果表明，与对照组或使用 Vin 或抗 PD-1 抗体的单一疗法相比，联合治疗显着增强了肿瘤抑制。这从肿瘤生长速度降低和肿瘤体积显着减小中可以明显看出（图 6 B-E）。重要的是，没有观察到体重的显着变化或明显的毒性迹象，这支持了联合治疗的安全性（图 6 D）。为了进一步验证 IL-24 在介导 Vin 抗肿瘤作用中的作用，作者比较了 rIL-24 单独使用和与抗 PD-1 抗体联合使用的疗效。rIL-24 和抗 PD-1 的联合治疗显著增强了 rIL-24 的抗肿瘤疗效，表明两者之间存在协同作用（图 6 B-E）。免疫组化和 ELISA 均证实了 rIL-24 在肿瘤组织内的有效递送[图 6F，图。S8 此外，免疫组织化学染色显示，IL-24 表达在 Vin 治疗后的肿瘤中显着上调 （图 6F）， 进一步支持其作为 Vin 诱导信号传导下游效应子的作用。 组织学分析显示，与 Vin、抗 PD-1 或 rIL-24 单一疗法相比，联合治疗显着降低了 Ki67 的表达，表明对肿瘤增殖的抑制更有效（图 6F-G）。根据所提出的机制，免疫荧光分析表明，Vin 处理的小鼠肿瘤组织中 ATF3 表达显着上调（图。S8B），支持 P38/MAPK/ATF3 信号通路的体内激活及其在介导 IL-24 表达中的作用。此外，流式细胞术分析显示，与个别治疗相比，联合疗法显着增加了 CD8⁺ T 细胞浸润到 TME 中，同时减少了 Treg 细胞浸润[图 6H，图 S8 此外，联合组 CD8⁺ T 细胞中 IFNγ 和 GZMB 表达显着升高（图 6I）. 这些发现表明，Vin 通过调节肿瘤免疫微环境和增强抗肿瘤免疫反应来增强 PD-1 阻断治疗的疗效。
Vin 和 PD-1 阻断的组合抑制黑色素瘤的生长。A 携带 B16F10 肿瘤的 C57BL/6 小鼠的治疗方案示意图，包括 PBS、抗 PD-1、Vin、Vin + 抗 PD-1、rIL-24 和 rIL-24 + 抗 PD-1 组。B 从治疗小鼠身上解剖的 B16F10 肿瘤的代表性图像。C 在治疗期间测量小鼠体重。D，E 接受指定治疗的 C57BL/6 免疫功能态小鼠中 B16F10 肿瘤的肿瘤生长曲线。n = 5。根据单因素方差分析，数据以均值± SD、*p < 0.05、p < 0.001 表示。F 肿瘤组织中 Ki67 和 IL-24 的免疫组织化学染色。比例尺，100 μm。IHC 染色的统计分析如（G）所示。n = 5。根据单因素方差分析，数据以均值± SD、ns.、不显着、**p < 0.01、p < 0.001 表示。H 肿瘤组织中 CD8+ T 细胞、GZMB+CD8+ T 细胞、IFNγ+CD8+ T 细胞和 Treg 细胞的流式细胞术分析。n = 5。根据单因素方差分析，数据以平均值表示± SD、ns.、不显着、**p < 0.01、p < 0.001。I.g.：胃内给药，I.p.：腹膜内注射，I.m.：肌肉注射
黑色素瘤中 IL-24 的高表达与抗肿瘤免疫呈正相关
为了进一步探讨黑色素瘤肿瘤中 IL-24 表达、CD8+ T 细胞浸润、抗 PD-1 治疗的反应及其对患者预后的潜在影响之间的相关性，作者首先分析了来自公共数据库的数据。TCGA 黑色素瘤数据的 EPIC 评分显示，与低表达组相比，高 IL-24 表达组的 B 细胞和 CD8+ T 细胞浸润显着增加。在内皮细胞、CD4+ T 细胞、巨噬细胞或 NK 细胞的浸润方面没有观察到显着差异（图。S9A）. 接下来，作者使用 SKCM_GSE72056 单细胞数据集检查了不同细胞类型中 IL-24 的表达。IL-24 在 B 细胞中高表达，但在恶性细胞和内皮细胞中表达低（图。S9B）. 有趣的是，虽然 IL-24 表达与黑色素瘤患者的总生存期无关（图。S9C），但它与接受抗 PD-1 治疗的患者的生存结局改善有关（图。S9D）. 进一步的分析表明，尽管其表达在治疗前后没有显着差异，但对抗 PD-1 治疗有反应的黑色素瘤患者的 IL-24 水平显着升高（图。S9E-F）。这表明抗 PD-1 治疗可能不会直接调节 IL-24 的表达。综上所述，这些发现强调了黑色素瘤中高 IL-24 表达与增强抗肿瘤免疫反应之间的密切关联。此外，IL-24 可能在调节抗 PD-1 治疗的有效性和影响患者预后方面发挥作用。
总结
综上所述，作者的研究结果表明，长春荏碱是一种具有多方面抗肿瘤活性的化合物，可诱导黑色素瘤细胞产生 ROS，导致细胞凋亡。此外，它还激活 P38/MAPK/ATF3 信号通路，刺激黑色素瘤细胞分泌 IL-24，有助于重塑免疫抑制 TME 并增强 CD8+ T 细胞介导的免疫反应（图 1）。 值得注意的是 ，长春荏碱与抗 PD-1 疗法的联合使用显示出协同作用，凸显了其作为黑色素瘤治疗新疗法的潜力。
|