低剂量二甲双胍通过 PEN2 靶向溶酶体 AMPK 通路
二甲双胍是最常处方的抗糖尿病药物，并已显示出其他益处，如抗衰老和抗癌作用。对于临床剂量的二甲双胍，AMP活化蛋白激酶在其作用机制中起主要作用；然而，二甲双胍的直接分子靶点仍然未知。本文我们显示临床相关浓度的二甲双胍抑制溶酶体质子泵v-ATPase，这是葡萄糖饥饿后AMPK激活的中心节点。我们合成了一种光活性二甲双胍探针，并鉴定出γ-分泌酶的一个亚基PEN2，是二甲双胍的结合伴侣，其解离常数在微摩尔水平。与二甲双胍结合的PEN2与v-ATPase的一个亚基ATP6AP1形成复合物，这导致v-ATPase的抑制和AMPK的激活，而不影响细胞AMP水平。敲除PEN2或重新引入不能结合ATP6AP1的PEN2突变体会削弱AMPK的激活。在体内，肝脏特异性敲除Pen2废除了二甲双胍介导的肝脏脂肪含量降低，而肠道特异性敲除Pen2损害了其降糖效果。此外，在秀丽隐杆线虫中敲低pen2消除了二甲双胍诱导的寿命延长。总之，这些发现揭示了二甲双胍结合PEN2并启动一条信号通路，该通路通过ATP6AP1与溶酶体葡萄糖感应通路相交，从而激活AMPK。这确保了二甲双胍在患者中发挥其治疗益处而没有显著的不良反应。
引言：
二甲双胍是降低2型糖尿病患者血糖水平的常用一线药物。它还具有其他临床有益效果，如降低体重和肝脏脂肪含量，以及降低服用该药的糖尿病患者的癌症发病率。给各种生物体（包括线虫和小鼠）施用二甲双胍也可以延长寿命和健康寿命。二甲双胍需要OCT家族的转运蛋白进入细胞，这限制了其主要靶器官为肝脏、肾脏和肠道。已经提出了二甲双胍发挥其作用的各种机制。二甲双胍可以抑制肝细胞中线粒体电子传递链的复合物I，这导致ATP减少和AMP增加，进而通过典型的腺嘌呤核苷酸依赖性机制激活AMPK。增加的AMP也抑制果糖-1,6-二磷酸酶-1和腺苷酸环化酶以阻断糖异生。也有人提出二甲双胍改变细胞氧化还原状态，从而增加NAD /NADH比率并导致糖异生底物利用的抑制。二甲双胍也可能通过促进胰高血糖素样肽1的分泌在肠道中发挥其降糖作用。
在已鉴定的二甲双胍的各种潜在效应器中，AMPK，代谢稳态的主要控制器，已被置于中心舞台。通过磷酸化乙酰辅酶A羧化酶1和ACC2，AMPK对于给予长期二甲双胍治疗的糖尿病小鼠肝脏脂肪变性和动脉粥样硬化的减轻是不可或缺的。十二指肠中AMPK的激活对于L细胞中GLP-1的分泌至关重要，并且是口服二甲双胍时其急性降糖效果所必需的。此外，二甲双胍介导的线虫衰老延缓是通过AMPK依赖性机制实现的。
人们普遍认为二甲双胍通过抑制线粒体电子传递链的复合物I来激活AMPK，这会损害ATP合成，进而增加AMP/ATP和ADP/ATP比率。然而，能量水平的降低只能在小鼠高剂量二甲双胍后的峰值浓度下观察到（>250 mg kg−1−1口服），这会在1-2小时后产生125–150 μM的峰值血浆浓度，并在此后迅速下降。相比之下，据报道，服用标准临床剂量1.5–2克每天的患者血浆二甲双胍浓度仅为5–30 μM，这可能不足以增加AMP/ATP和ADP/ATP比率。因此，有必要探索临床相关剂量的二甲双胍如何激活AMPK。
PEN2 与二甲双胍结合
我们发现临床剂量的二甲双胍足以抑制溶酶体上的液泡 H -ATPase（图 1a, b 和 扩展数据图 1，详细讨论见补充说明 1）。因此，我们使用基于亲和力的方法分析纯化溶酶体的蛋白质提取物，以鉴定二甲双胍的潜在直接靶点（图 2a）。合成了两种类型的光活性二甲双胍探针，Met-P1 和 Met-P2（扩展数据图 2a），但只有 Met-P1 能够抑制溶酶体酸化；Met-P2 没有效果，因此被弃用（扩展数据图 2b）。与溶酶体裂解物孵育后，Met-P1 通过紫外线照射与蛋白质结合，然后进行生物素化（化学反应如扩展数据图 2c 所示）。使用 NeutrAvidin 珠子下拉结合物用于质谱分析。如补充表 1 所列，我们总共设计了 367 个蛋白质的表达质粒，并验证了其中 113 个蛋白质在 HEK293T 细胞中单独表达时可以被 Met-P1 下拉（补充说明 2）。接下来，我们通过慢病毒介导的短发夹 RNA 沉默，分别敲低了小鼠胚胎成纤维细胞中的这 113 个蛋白质。我们观察到，消耗 PEN2，而非其他蛋白质，使细胞对二甲双胍处理不敏感，这是通过 AMPK 激活水平和 v-ATPase 抑制来评估的（扩展数据图 2d 和 3a, b）。一致地，敲除 PEN2 阻断了低剂量二甲双胍诱导的原代肝细胞、MEFs 和 HEK293T 细胞中的 AMPK 激活和 v-ATPase 抑制（图 2b, c 和 扩展数据图 3c–i, k, l；注意敲除 PEN2 不影响基础溶酶体 pH 水平（补充说明 2））。值得注意的是，在所有三种细胞类型中消耗 PEN2 并不影响二甲双胍进入细胞的转运（扩展数据图 3j）。PEN2 最初被鉴定为 γ-分泌酶的一个组分。与 PEN2 不同，γ-分泌酶的其他亚基不直接参与低剂量二甲双胍的 AMPK 激活（扩展数据图 3m–s, 4a, b 和 6m–o；关于二甲双胍和 γ-分泌酶之间关系的详细讨论在补充说明 3 中提供）。共聚焦显微镜成像（扩展数据图 4c）、随机光学重建显微镜（图 2d）和基于 APEX 标签的透射电子显微镜（图 2e，验证数据在扩展数据图 4d）显示，一部分 PEN2 定位于溶酶体上。这一发现在亚细胞分级分离实验中得到证实（扩展数据图 4e，关于 PEN2 定位的详细讨论在补充说明 4 和扩展数据图 4f, g 和 5a 中提供），并且二甲双胍不改变 PEN2 的亚细胞定位（扩展数据图 5b, c）。这些结果表明，位于溶酶体的 PEN2 池可能具有独特的作用，即它参与二甲双胍诱导的 AMPK 激活（在补充说明 5 中讨论）。实际上，将 PEN2 与其他细胞器特异性蛋白融合的构建体，当重新引入 Pen2–/– MEFs 时，不能恢复二甲双胍对 AMPK 的激活（扩展数据图 5d，验证数据在扩展数据图 5d, e）。
高浓度的二甲双胍可以增加细胞 AMP 水平，后者可以变构激活 AMPK；因此，预计由高浓度二甲双胍诱导的 AMPK 激活将是溶酶体非依赖性的。确实，高浓度的二甲双胍，增加了 AMP/ATP 和 ADP/ATP 比率（扩展数据图 1m–p），绕过了 PEN2 对 AMPK 激活的要求，苯乙双胍和丁双胍也是如此（扩展数据图 5f）。此外，PEN2 缺陷不影响葡萄糖饥饿诱导的 AMPK 激活（扩展数据图 5g）或其他激动剂（扩展数据图 5g, h）。
我们接下来研究了 PEN2 与二甲双胍结合的生物物理性质。差示扫描量热分析显示，在存在二甲双胍的情况下，热转变中点发生偏移（扩展数据图 6a）。等温滴定量热和表面等离子共振测量进一步给出了估计的解离常数值，分别为 1.7 µM 和 0.15 µM（结合速率常数值为 2,815 M−1−1s−1−1）。这些值在给予常规剂量的动物或人类患者中检测到的细胞内二甲双胍浓度范围内（图 2f 和 扩展数据图 6b, f，详细讨论在补充说明 6 中）。ITC 测量给出了一个额外的二甲双胍结合位点，其 KD 值高得多，为 98 µM，这超出了临床相关的细胞内二甲双胍浓度范围（扩展数据图 6b）。作为对照，其他 γ-分泌酶亚基未显示与二甲双胍有明显的结合亲和力（扩展数据图 6c）。我们还对与 Met-P1 结合的纯化 PEN2 进行了质谱分析，以确定负责结合二甲双胍的残基。结果，鉴定出 PEN2 的 Y47 残基（扩展数据图 6d），这表明二甲双胍可能能够结合氨基末端的胞质面。计算机模拟进一步说明，在 PEN2 的 N 端区域，二甲双胍通过 PEN2 上的 F35 和 E40 残基与 PEN2 形成直接接触（扩展数据图 6e）。确实，将 PEN2 上的 F35 和 E40 突变为丙氨酸（PEN2-2A）阻断了其与二甲双胍的相互作用（图 2g 和 扩展数据图 6f）。将 PEN2-2A 重新引入 Pen2–/– MEFs 不能恢复二甲双胍诱导的 AMPK 激活或 v-ATPase 抑制，即使 PEN2-2A 与野生型 PEN2 具有相似的亚细胞定位（图 2h 和 扩展数据图 6h，验证数据在扩展数据图 6g, i）。质谱结果还揭示了 PEN2 羧基末端（腔面）的一个额外的、但弱得多的二甲双胍结合位点。鉴于二甲双胍可能通过内吞作用被运输并可能存在于溶酶体腔内，我们检查了二甲双胍与 PEN2 C 末端可能存在的结合。我们发现，该位点残基的突变不会阻断二甲双胍结合或削弱 AMPK 激活（扩展数据图 6d, j–l）。
Figure 1 : 二甲双胍激活 AMPK 而不增加 AMP/ADP 水平。
a, 低剂量二甲双胍使小鼠原代肝细胞中的溶酶体去酸化（左图）。细胞用 5 μM 二甲双胍处理 2 小时，显示 LysoSensor 的相对荧光强度（右图）。b, 二甲双胍不增加小鼠原代肝细胞中的 AMP/ADP 水平。细胞用 5 μM 二甲双胍处理指定时间，然后通过免疫印迹分析磷酸化 AMPKα 和 p-ACC（左图），通过质谱分析 AMP/ATP 和 ADP/ATP 比率，以及 AMP、ADP 和 ATP 的绝对浓度（右下角）。用 PBS 洗涤三次后，通过质谱测量细胞内二甲双胍浓度（右上角）。关于凝胶源数据，见补充图 1。数据为平均值 ± 标准误，n 值标注在每个面板上。P 值使用双尾 Mann-Whitney 检验（a）或单因素方差分析（ANOVA）后接 Tukey（b，右下角）或 Sidak 检验（b，右上角）计算。a 中的实验进行了三次，b 中的实验进行了五次。
Figure 2 : PEN2 与二甲双胍结合并且是低剂量二甲双胍诱导的 AMPK 激活所必需的。
a, 示意图描述了使用光活性二甲双胍探针从纯化的 MEFs 溶酶体蛋白质提取物中鉴定二甲双胍靶点的基于亲和力的方法流程。MS，质谱。b, c, 敲除 Pen2 阻断了低剂量二甲双胍对 AMPK 的激活。小鼠原代肝细胞（b）和 MEFs（c；克隆 1，此后除非另有说明，均相同）分别用 5 μM 和 200 μM 二甲双胍处理 2 小时和 12 小时，然后分析 p-AMPKα 和 p-ACC。WT，野生型。d, e, MEFs 的 STORM 图像（d）和 HEK293T 细胞的 TEM 图像（e）显示一部分 PEN2 定位于溶酶体（e，黑色箭头）并与溶酶体标记物 LAMP2 重叠（d）。f, g, PEN2 能够结合二甲双胍。f, 在 SPR 分析中，PEN2 与指定浓度的二甲双胍孵育。g, 在 Met-P1 结合分析中，转染了 PEN2 或 PEN2-2A 的 HEK293T 细胞被裂解，与 10 μM Met-P1 孵育，然后进行生物素化，然后进行生物素化蛋白质的亲和下拉。TCL，总细胞裂解物。h, PEN2-2A 不介导二甲双胍的 AMPK 激活。重新引入 HA 标记的 PEN2-2A 的 Pen2–/– MEFs 用 200 μM 二甲双胍处理 12 小时，然后分析 p-AMPKα 和 p-ACC。关于凝胶源数据，见补充图 1。本图中的实验进行了三次，除了 b 和 c 进行了四次。
ATP6AP1 将 PEN2 拴在 v-ATPase 上
我们接下来研究了二甲双胍结合如何导致 PEN2 与 v-ATPase 相交并抑制它。我们通过质谱分析了与溶酶体蛋白质提取物孵育后免疫沉淀的 PEN2。在 PEN2 的猎物中总共检测到 1,881 个蛋白质，其中 889 个在二甲双胍处理后发生变化。在这 889 个蛋白质中，有 123 个是溶酶体驻留蛋白（补充表 2）。在这 123 个候选蛋白中，我们对 ATP6AP1特别感兴趣，它是 v-ATPase 的一个辅助因子，因为它与 PEN2 的依赖二甲双胍的相互作用可以通过细胞和体外的共免疫沉淀实验验证（图 3a–c 和 扩展数据图 7a, b）。结构域映射实验确定，构成 ATP6AP1 跨膜结构域的氨基酸残基 420 至 440，负责与 PEN2 结合（扩展数据图 7c）。这一发现得到了使用嵌合构建体 LAMP2TM–ATP6AP1 的实验结果的加强，该构建体将 ATP6AP1 的跨膜结构域替换为溶酶体蛋白 LAMP2 的跨膜结构域。该构建体不与 PEN2 相互作用（扩展数据图 7d）。此外，PEN2 在其与 ATP6AP1 相互作用的界面上的突变（基于计算机对接分析；PEN2-20A），损害了 PEN2 与 ATP6AP1 的相互作用（图 3d 和 扩展数据图 7e–g）。值得注意的是，ATP6AP1 本身不结合 Met-P1（扩展数据图 7h）。总之，这些结果表明，与二甲双胍结合后，溶酶体 PEN2 被招募到 v-ATPase 复合物的 ATP6AP1。
我们接下来检查了 ATP6AP1 如何介导二甲双胍对 v-ATPase 的抑制。首先，作为 v-ATPase 的一个组成部分，敲除 ATP6AP1 导致 AMPK 的组成型激活（扩展数据图 7i–k）。当我们将缺失与 PEN2 相互作用所需的跨膜结构域的截短 ATP6AP1 突变体（Δ420–440）重新引入 Atp6ap1–/– MEFs 时，v-ATPase 的基础活性得以恢复（扩展数据图 8a，验证数据在扩展数据图 7i）。值得注意的是，ATP6AP1 Δ420–440 突变体不介导二甲双胍诱导的 v-ATPase 抑制或 AMPK 激活（图 3e 和 扩展数据图 8b, c）。当将 LAMP2TM–ATP6AP1 嵌合构建体重新引入 Atp6ap1–/– MEFs 时，观察到类似的 v-ATPase 活性恢复以及 AMPK 激活的阻断（扩展数据图 8a, d，验证数据在扩展数据图 7i）。此外，将不能与 ATP6AP1 相互作用的 PEN2-20A（即使其定位方式与野生型 PEN2 相似（扩展数据图 8e））重新引入 Pen2–/– MEFs，阻断了 AMPK 的激活和 v-ATPase 的抑制（图 3f 和 扩展数据图 8f）。这些结果表明，与二甲双胍结合的 PEN2，通过获得对 ATP6AP1 的亲和力，抑制 v-ATPase 以激活 AMPK。
我们之前报道过，葡萄糖剥夺可以通过 v-ATPase、Ragulator 和 AXIN 激活溶酶体 AMPK，而不增加 AMP/ADP 水平，这些位于果糖-1,6-二磷酸传感器醛缩酶的下游。在肝脏、MEFs 或 HEK293T 细胞中敲除 AXIN、LAMTOR1或 v-ATPase 的 V0C 亚基，阻断了低剂量二甲双胍对 AMPK 的激活（扩展数据图 9a–h）。将不能定位于溶酶体上的 AMPKβ1-G2A 突变体重新引入 AMPKβ1 和 AMPKβ2 均缺陷的 MEFs，也阻断了低剂量二甲双胍对 AMPK 的激活（扩展数据图 9a–h）。此外，高浓度的二甲双胍绕过了 AXIN 和 LAMTOR1 对 AMPK 激活的要求（扩展数据图 9a–c, h）。PEN2 和 ATP6AP1 似乎作为 AXIN 和 LAMTOR1 的上游因子，通过它们对 v-ATPase 的调节。这是基于以下事实：在用二甲双胍处理时，AXIN 的溶酶体易位以及基于 AXIN 的复合物的形成在 Pen2–/– MEFs、表达 PEN2-2A 或 PEN2-20A 突变体的 Pen2–/– MEFs 以及表达 ATP6AP1 Δ420–440 突变体的 Atp6ap1–/– MEFs 中被削弱（图 3g–i，扩展数据图 9j–l 和 10a, b）。用 v-ATPase 抑制剂 concanamycin A 阻断 v-ATPase 恢复了这些表型（图 3g–i，扩展数据图 9j, k, 10a, b 和 11a, b）。作为额外的对照，将低葡萄糖信号传递给 v-ATPase 和 AMPK 所需的醛缩酶和 TRPV，对于 PEN2 感知的二甲双胍 AMPK 激活是可有可无的。这一结果得到以下证据的支持：（1）表达 ALDOA-D34S，其模拟高葡萄糖状态并阻断葡萄糖剥夺诱导的 AMPK 激活（扩展数据图 11c），不阻断二甲双胍诱导的 AMPK 激活（扩展数据图 11d, e）；以及（2）MEFs 中 Trpv1–Trpv4 的四重敲除，或 Trpv1–/– 小鼠肝脏中 Trpv2–Trpv4 的敲低（使那些细胞或组织中 TRPV 表达稀少），在用二甲双胍处理时不影响 AMPK 的激活（扩展数据图 11f, g）。总之，PEN2–ATP6AP1 作为一条相交的分流，传递二甲双胍的信号，以抑制 v-ATPase，这为 AXIN 和 LKB1 向溶酶体表面的溶酶体易位以磷酸化和激活 AMPK 做好准备（示意图见图 3j）。
Figure 3 | ATP6AP1 将 PEN2 拴在 v-ATPase 上以激活 AMPK。
a–c, 鉴定 ATP6AP1 为 PEN2 的相互作用蛋白。表达 HA–PEN2 或 Myc–ATP6AP1 的 HEK293T 细胞裂解物（a），以及来自野生型 MEFs、Pen2–/– MEFs（b）或 Atp6ap1–/– MEFs（c）的裂解物与 10 μM 二甲双胍孵育，并对 PEN2 和 AP1 蛋白进行免疫沉淀。d, 二甲双胍不促进 ATP6AP1 与 PEN2-20A 之间的相互作用。转染了 HA 标记的 PEN2 或 PEN2-20A 的 HEK293T 细胞被裂解并如 a 中处理。通过 IP 然后 IB 分析 ATP6AP1 与 PEN2 的相互作用。e–i, 失去 PEN2–ATP6AP1 相互作用消除了二甲双胍对 AMPK 激活的影响。重新引入 ATP6AP1Δ420–440 的 Atp6ap1–/– MEFs（e）或重新引入 PEN2-20A 突变体的 Pen2–/– MEFs（f）用 200 μM 二甲双胍处理 12 小时，然后分析 p-AMPK 和 p-ACC。g–i, 分析了 ATP6AP1 和 PEN2 突变体对 AXIN 溶酶体易位（g）和基于 AXIN 的复合物形成（h, i）的影响。Concanamycin A（conA；5 μM 处理 2 小时）用作对照。FL，全长。j, 示意图描绘了二甲双胍–PEN2–ATP6AP1 和 FBP–醛缩酶轴构成两个传入分流，它们在 v-ATPase 处汇合，通过溶酶体通路引发 AMPK 激活。关于凝胶源数据，见补充图 1。数据为平均值 ± 标准误，n 值标注在每个面板上，P 值使用双尾 Student t 检验（a，针对 Myc–ATP6AP1）、带 Welch 校正的双尾 Student t 检验（a，针对 HA–PEN2）或双向 ANOVA 后接 Tukey 检验（g）计算。本图中的实验进行了三次，除了 a（四次）以及 h 和 i（五次）。
动物模型中的表型
我们接下来探索了 PEN2 和 ATP6AP1 在动物模型中介导二甲双胍有益功能的作用。我们观察到，在肠道中特异性耗尽 PEN2 的小鼠（PEN2-IKO 小鼠；生成方法如扩展数据图 12c, d 所示），其二甲双胍的餐后降血糖作用受损，类似于在肠道特异性 Ampka 敲除小鼠中观察到的情况（扩展数据图 12a, b）。我们还观察到二甲双胍对 GLP-1 和胰岛素分泌的促进作用受损（图 4a, b 和 扩展数据图 12e）。同时，肝脏特异性耗尽 PEN2（PEN2-LKO 小鼠；生成方法如扩展数据图 12f 所示）导致小鼠肝脏中 AMPK 激活的强烈损害。给高脂饮食诱导的肥胖小鼠服用二甲双胍 4 个月以降低肝脏甘油三酯水平以及改善葡萄糖耐量的效果也受损（图 4c, d 和 扩展数据图 12g–k）。类似地，将 ATP6AP1 Δ420–440 重新引入 Atp6ap1 敲除的小鼠肝脏，不能挽救二甲双胍对 AMPK 激活或 TAG 水平降低的影响（图 4e, f 和 扩展数据图 12f–i）。因此，PEN2 和 ATP6AP1 是二甲双胍通过激活溶酶体 AMPK 通路减少肝脏脂肪的作用所必需的。
我们还测试了二甲双胍诱导的寿命延长是否依赖于 PEN2 和 ATP6AP1。与之前的报告一致，50 mM 的二甲双胍能够延长线虫的寿命（扩展数据图 13a），并且未观察到 AMP/ATP 和 ADP/ATP 比率的增加（扩展数据图 13b）。敲低 T28D6.9，即 PEN2 的线虫直系同源物，阻断了二甲双胍诱导的线虫寿命延长效应（图 4g，扩展数据图 13b, c 和 补充表 3，验证数据在扩展数据图 13d）。类似地，在 Atp6ap1–/– 线虫中表达哺乳动物 ATP6AP1 Δ420–440，损害了二甲双胍诱导的 AMPK 激活和寿命延长效应（图 4h，扩展数据图 13f, i 和 补充表 3）。值得注意的是，对 Pen2 和 Atp6ap1 的遗传操作或培养板上的活细菌不影响二甲双胍的细胞摄取（扩展数据图 13e, j, k）。最后，我们检查了含有 0.1% 二甲双胍的正常饲料饮食对肝脏耗尽 PEN2 或表达 ATP6AP1 Δ420–440 的小鼠 AMPK 激活的影响。在这两种小鼠品系中，AMPK 的激活都强烈减弱（图 4i, j 和 扩展数据图 13l）。总之，PEN2 与 ATP6AP1 结合，似乎负责二甲双胍的三个主要生物学益处：降低血糖水平、减少肝脏脂肪含量和延长寿命。
Figure 4 : PEN2 和 ATP6API 是二甲双胍生物学效应所必需的。
a, b, 肠道 PEN2 是二甲双胍诱导的降血糖效应所必需的。PEN2-KO 小鼠按照扩展数据图 12d 所示给予二甲双胍。然后进行口服葡萄糖耐量试验分析（a）、十二指肠二甲双胍浓度测量（b，左图）以及灌胃葡萄糖前和灌胃后 15 分钟的血浆 GLP-1 水平测量（b，右图）。c, d, PEN2 是二甲双胍诱导的肝脏脂肪减少所必需的。肝脏中特异性敲除 Pen2 的小鼠（LKO）按照扩展数据图 12f 所示用二甲双胍处理。显示了二甲双胍治疗 16 周后小鼠的腹腔葡萄糖耐量试验结果（c）和肝脏 TAG 水平（d）。e, f, ATP6API 是二甲双胍诱导的肝脏脂肪减少所必需的。小鼠按照扩展数据图 12m 所示处理。显示了二甲双胍治疗 16 周后小鼠的腹腔葡萄糖耐量试验结果（e）和肝脏 TAG 水平（f）。g, h, PEN2 和 ATP6API 是二甲双胍诱导的线虫寿命延长所必需的。使用 siRNA 敲低 pen-2 的 WT（N2）线虫（g）或 ATP6API–/– 线虫，其中重新引入全长 ATP6API 或 ATP6API Δ420–440 突变体（图 3d 和 扩展数据图 7e–g）。值得注意的是，ATP6API 本身不结合 Met-P1（扩展数据图 7h）。总之，这些结果表明，与二甲双胍结合后，溶酶体 PEN2 被招募到 v-ATPase 复合物的 ATP6AP1。
讨论:
在这里，我们鉴定出 PEN2 是二甲双胍的一个靶点。刺激后，PEN2 与 v-ATPase 的 ATP6AP1 亚基结合并抑制其活性，而不增加 AMP 或 ADP，然后激活溶酶体 AMPK。因此，PEN2–ATP6AP1 轴构成了一条信号分流，与溶酶体 v-ATPase–AXIN–AMPK 轴相交，这使得低浓度的二甲双胍能够利用不依赖 AMP 的 AMPK 激活通路，该通路也可以由葡萄糖饥饿触发。我们还确定了 PEN2–ATP6AP1 通路不参与低葡萄糖水平下的 AMPK 激活，这表明 PEN2–ATP6AP1 轴是通往 v-ATPase 复合物的平行途径。因此，PEN2–ATP6AP1 和醛缩酶–TRPV 这两个轴分别感知二甲双胍的存在和葡萄糖水平的降低，并作用于 v-ATPase 以控制 AMPK 的激活。这一发现强调了 v-ATPase 作为溶酶体 AMPK 激活信号节点的重要作用（扩展数据图 13m）。
我们还表明，PEN2–ATP6AP1 轴是二甲双胍三个主要有益作用所必需的：餐后血糖降低、肝脏脂肪减少和寿命延长，所有这些都严格依赖于 AMPK（扩展数据图 13g, h, 14a–i 和 补充说明 7–9）。我们的数据也与之前的发现一致，即二甲双胍可以在肠道中促进 GLP-1 分泌以降低血糖，这是以 AMPK 依赖性方式进行的，除非服用高剂量的二甲双胍。然而，尽管已显示二甲双胍也能抑制肝脏糖异生，但我们发现低剂量的二甲双胍没有这样做，这是通过丙酮酸耐量试验和糖异生基因的定量评估的（扩展数据图 14j, k）。此外，除了激活 AMPK 之外，我们还发现 PEN2–ATP6AP1 轴是二甲双胍抑制 mTORC1 信号所必需的（扩展数据图 14l–n）。然而，mTORC1 抑制似乎不参与上述由 AMPK 介导的有益作用（补充说明 10）。
二甲双胍信号与溶酶体 AMPK 通路的相交，而不扰动 AMP/ADP 水平，可能解释了为什么二甲双胍能发挥许多益处而副作用很少。该通路只允许一小部分 AMPK 池的激活，并且这种先天通路可能与热量限制有关，与全局 AMPK 激活相比，更不可能引起不良反应。已有研究表明，不加区别的 AMPK 激活会导致有害而非有益的效果。例如，AMPK 激活剂 MK-8722，似乎激活所有常见组合的 AMPK 亚基，可导致心脏肥大。此外，PRKAG2中自然发生的突变，导致 AMPK 基础活性增加，与心脏疾病相关。总之，我们鉴定出 PEN2 是二甲双胍的分子靶点，它与葡萄糖感应通路相交以激活 AMPK，从而引发类似于葡萄糖饥饿或热量限制诱导的益处。PEN2–ATP6AP1 轴为筛选二甲双胍的替代物提供了潜在靶点，这些替代物可能适用于更广泛的组织，例如肌肉，从而在治疗糖尿病和其他代谢疾病方面产生更好的疗效。