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结果：
识别 IPF 与正常肺组织之间的 DEGs 和 PAN-DEGs
最初，从 GEO 数据库获得了包含 373 个 IPF 和 158 个对照肺组织样本的综合数据集，并剔除了批量效应，生成了整合的基因表达谱（见图 2A 和 B）。总体来看，在火山图中识别并可视化了 663 个上调和 667 个下调 DEGs（见图 2C）。其中，BPIFB1、MSMB、MMP1、SPP1 和 MMP7 是 IPF 患者肺组织中上调最严重的五个基因，而 IL1RL1、ANKRO1、AGTR2、MATN3 和 FAM167A 表现出最显著的下调表达（见图 2D）。终极免疫细胞分析显示，DEGs 主要与凋亡信号传导、细胞增殖和粘附过程相关，分子功能富含细胞因子活性、受体结合和 DNA 结合转录激活剂活性（见图 2E）。KEGG 分析发现了与细胞衰老、细胞周期以及包括 MAPK、Hippo、FoxO 和 p53 在内的关键信号通路的显著关联（见图 2F）。
在特发性肺纤维化（IPF）和正常对照（NC）样本GSE32537 和 GSE47460 数据集中的基因表达和功能注释比较分析。（A） PCA 图，显示两个数据集之间的分离情况。（B） PLS-DA 图，展示数据集间的区分情况。（C）差异表达基因的火山图，红色为上调基因，蓝色为下调基因，灰色为无显著基因。（D）IPF 和 NC 样本之间顶部差异表达基因的热图，红色样本表达较高，蓝色样本表达较低。（E）生物过程的 GO 富集分析条形图，点大小表示基因计数，颜色表示调整后的 p 值。（F） KEGG 通路富集分析条形图，点大小表示基因比，颜色表示 p 值。
IPF 中 PANopsosis 相关基因与 DEGs 的交汇揭示了 30 个交集基因，其中包括 12 个上调基因和 18 个下调基因（ 见图 3A 和 B）。热图展示了 IPF 中这些 PAN-DEG 的表达曲线（ 图 3C）。此外，WGCNA 分析识别出 25 个共表达模块，其与图 3D、E 所示的特定特征相关。
分析 IPF 和 NC 样本中差异表达基因及基因共表达模块。（A 和 B）维恩图，显示合并数据集与全盆亡相关基因之间上调和下调基因的交集情况。（C）IPF 和 NC 样本中选定差异表达基因的热图，红色表表达较高，蓝表较低。（D）加权基因共表达网络分析中的基因树轮图和模块颜色。（E）模-性状关系热图，颜色表示模组特征基因与性状之间的相关性，值表示相关系数。
PPI 网络构建与 Hub PANoptosis 相关基因特征的识别
为了预测与 PANopsosis 相关基因组在 IPF 中的潜在功能和相互作用，使用在线工具 GeneMANIA（见图 4A）开展了 PPI 网络。通过机器学习识别了与泛性血管感染相关的枢纽基因，特别是利用 LASSO 回归、支持向量机（SVM）和随机森林算法来分离关键基因（见图 4B–D）。该分析建立了由五基因组成的 PANoptosis 相关特征，包括 GPX3、TIMP3、SMAD7、IGF1 和 GADD45β。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络及 PANoposis 相关基因的枢纽基因选择。（A）利用 GeneMANIA 生成的 PPI 网络，展示了 PANopsosis 相关蛋白之间的相互作用。（B）可变重要性图，突出显示顶部枢纽基因。（C）交叉验证 RMSE 以选择最优变量数量。（D）逻辑回归模型中具有不同λ值的二项偏差。
验证 Hub PANopsosis 相关基因表达及其诊断性能
内部数据集中 hub PANopsosis 相关基因的表达水平如图 5A 所示。在 IPF 肺组织中，IGF1 被发现上调，而 GPX3、TIMP3、SMAD7 和 GADD45β则下调。在初步发现之后，作者利用来自 GEO（GSE110147）的外部数据集进一步验证了基因表达，确认所有五个基因均保持统计显著性（见图 5B）。基因集变异分析（GSVA）表明，这些基因与多种通路显著相关，包括 TGF-β、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt/mTOR、NF-κB 和 p53。这一关联表明它们参与了上皮-间充质转变、细胞衰老、炎症、氧化应激、糖酵解和脂肪酸代谢等过程（见图 5C）。Circos 图展示了 PANopsosis 相关基因之间的相互关系，特别是 IGF1 与其他四个基因之间的负相关（见图 5D）。此外，ROC 曲线显示出强健的诊断能力，每个基因的 AUC 均超过 0.80。如预期，合并基因达到了最高的 AUC（0.945）（见图 5E）。
特发性肺纤维化（IPF）和正常对照（NC）样本中的基因表达分析及诊断表现。（A）显示 IPF 和 NC 样本联合数据集中枢纽基因表达水平的箱型图。（B）显示 GSE110147 数据集中同一枢纽基因表达水平的箱形图。（C）基因集富集分析结果的热图，展示了枢纽基因与多种生物通路之间的关联，颜色强度表示富集得分。（D） Circos 图，展示枢纽基因之间的相关性，相关强度由连接线的粗细表示。（E）中心基因的受试者工作特征曲线，显示其诊断表现与中心基因的曲线面积值。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
图 6A 展示了 IPF 和 NC 样本中不同免疫细胞类型的比例，显示出两组间显著差异。小提琴图进一步阐明了这些免疫细胞的分布，强调了如初生 B 细胞、记忆 B 细胞、浆细胞、T 细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等细胞类型的改变。图 6B 所示的热图分析展示了中心 PANopsosis 相关基因（IGF1、GADD45β、TIMP3、SMAD7 和 GPX3）表达水平与各种免疫细胞类型比例之间的相关性。这些相关性暗示了 PANopsosis 相关基因与 IPF 免疫微环境之间潜在的相互作用。
免疫细胞分数分析及与 IPF 和 NC 样本中枢基因表达的相关性。（A）小提琴图，显示 IPF 和 NC 样本中不同免疫细胞类型的分数。标示了各组间显著差异。（B）热图，展示了枢纽基因表达与各种免疫细胞类型分数之间的相关性，颜色强度表示相关系数。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
在博来麦素诱导肺纤维化模型中验证泛性死相关基因特征
为了进一步验证通过生物信息学分析识别出的五个 PANpoposis 相关候选基因的表达水平，作者建立了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。最初通过显微 CT 技术和肺组织学检查确认了这一发现，以确保小鼠肺纤维化模型的成功开发。如图 7A 所示，模型组胸部 CT 显示肺传播量减少，表现为非通气实质比例增加，支气管壁和间隙增厚。H&E 染色揭示了纤维化肺组织中正常肺泡结构的消失，取而代之的是炎症性细胞浸润和肺泡腔内组织细胞的增殖。此外，Masson 的三色染色和 Sirius 红染色证实了纤维化肺中胶原纤维过度沉积（见图 7B）。与正常对照组相比，特征基因在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化样本中显著表达，与外部验证的结果相符（见图 7C 和 D）。
博来霉素诱导小鼠肺纤维化的构建及体内基因表达分析。（A）显微 CT 显示肺纤维化（PF）和正常对照（NC）肺部的放射学变化。（B）H&E、Masson 和 Sirius 染色显示 PF 和 NC 左肺样本的病理变化。（C） qRT-PCR 验证 PF 和 NC 样本中枢纽基因的表达水平（每组 n=5 个）。（D）免疫组化（IHC）染色，验证 PF 和 NC 样本中枢基因的表达水平（每组 n=3 个）。*P < 0.05，**P < 0.01。
通过 ScRNA-Seq 揭示 IPF 肺组织中的细胞类型分布和枢纽基因表达
对 IPF 患者和健康对照组肺组织样本的分析显示，细胞类型分布和基因表达谱存在显著差异。统一流形近似与投影（UMAP）图展示了多种细胞类型的明显聚集，包括上皮细胞、T 细胞、内皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、浆细胞、成纤维细胞和 B 细胞，其中 IPF 样本中纤维母细胞比例显著更高（见图 8A）。簇评分热图显示不同细胞簇间表达水平存在差异，特定簇中得分升高表明 IPF 中某些细胞类型的活性或丰度增加（见图 8B）。展示不同细胞类型中枢纽基因比例和表达水平的热图显示出明显的模式。例如，GPX3 和 IGF1 在 IPF 样本中成纤维细胞和巨噬细胞中的表达显著增加，分别说明它们在纤维化和炎症通路中的潜在参与（见图 8C 和 D）。UMAP 绘制的单个枢纽基因图进一步描绘了不同细胞群体中的特定表达模式。GPX3 主要在成纤维细胞中上调，IGF1 在成纤维细胞和巨噬细胞中均有上调，SMAD7 在上皮细胞中，GADD45β在 T 细胞中，TIMP3 在内皮细胞中表现。这些发现表明这些基因在不同细胞类型中发挥的多样功能，并强调了 IPF 与对照样本之间的显著差异（见图 8E–I）。
特发性肺纤维化（IPF）和正常对照（NC）样本中的细胞类型分布及枢纽基因表达。（A）UMAP 图，显示 IPF 和 NC 样本中不同细胞类型的分布。（B）IPF 和 NC 样本中细胞簇分数的热图，簇列在右侧，颜色代表分数水平;分数越高，颜色越亮。（C）热图，显示 IPF 和 NC 样本中不同细胞类型中表达枢纽基因的比例，颜色强度表示比例;较深的红色表示比例较高。（D）展示 IPF 和 NC 样本中不同细胞类型中枢纽基因表达水平的热图，颜色强度表示表达水平;更深的红色表示更高的表情。（E–I）UMAP 图展示了 IPF 和 NC 样本中单个枢纽基因在细胞群体中的表达情况。每张图突出显示表达特定基因的细胞，阳性细胞以橙色标注，不表达细胞以灰色标示。
总结
总之，本研究发现了若干潜在参与泛性磷灭亡和 IPF 过程的新靶点，这些目标可能成为 IPF 的潜在诊断生物标志物。更重要的是，作者的发现表明这些基因与多种免疫细胞相关，并在肺部细胞内提供了潜在的分布信息。还需要更多研究来阐明这些基因在 IPF 发病机制中的生物学功能和机制。
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