1175-GLI1/2基因改变的间叶性肿瘤：8例病例研究拓展了临床病理和分子谱系（包括上游PTCH1失活突变）
摘要
GLI1/2基因改变可驱动包含基因重排和扩增的间叶性肿瘤。受累患者年龄分布广、肿瘤部位多样且组织学多变。我们描述8例病例（7女1男，年龄15-82岁）的临床病理和分子特征。肿瘤位于卵巢（3例）、子宫内膜（1例）、腹膜后（1例）、皮肤（1例）、颈部（1例）和下咽（1例）。病例表现为上皮样（2例）、梭形细胞（1例）、双相型（1例）或圆形细胞（3例）形态学特征，其中2例圆形细胞肿瘤伴显著黏液样间质。1例肿瘤呈多形性伴活跃核分裂。免疫组化显示S100、广谱角蛋白AE1/3、EMA、CD56、SYN和CgA表达不一。GLI1扩增病例中检测到MDM2、CDK4和STAT6表达。3例肿瘤发现融合基因（GLI1::MALAT1两例，PTBP1::GLI2一例）。3例存在GLI1扩增（其中2例伴MDM2/CDK4共扩增），1例存在GLI2扩增，另1例携带PTCH1失活突变。通过RNA表达和DNA甲基化分析，这些病例形成独立聚类。GLI扩增肿瘤发生于老年患者（3例），均在3-27个月内死亡；而携带GLI融合基因和PTCH1突变的肿瘤见于年轻患者（3例），均保持无病状态（25-31个月）。结论表明：我们的GLI1/2改变间叶性肿瘤在RNA水平和表观遗传学上形成聚类，证实其构成统一疾病实体（包括PTCH1突变肿瘤）。扩增型肿瘤多见于老年患者且更具侵袭性，而融合基因型肿瘤好发于年轻患者且预后良好。
引言
位于12号染色体（12q13.3–14.1）的胶质瘤相关癌基因同源物1（GLI1）于1987年首次在多形性胶质母细胞瘤中被报道存在扩增。作为Kruppel家族重要转录因子，GLI1是音猬因子（HH）信号通路的终末效应器。虽然HH信号参与正常细胞生长和分化，但其异常激活可导致髓母细胞瘤、多种癌（如基底细胞癌）和黑色素瘤等肿瘤发生。Gorlin-Goltz综合征就是遗传性HH信号紊乱的代表性疾病，表现为多种异常和不同癌症的发生。
2004年，在被称为”伴t(7;12)易位的血管外皮细胞瘤”病例中首次报道了涉及7号染色体β-肌动蛋白基因（ACTB）的GLI1融合基因。此后发现GLI1改变（包括作为重排替代形式的扩增）存在于多种上皮样和梭形细胞肿瘤中，患者年龄分布广且解剖部位多样。最常见的融合伙伴（非排他性）包括MALAT1、PTCH1、FOXO4和ACTB。扩增病例中常伴12q上相邻基因MDM2、CDK4、STAT6、DDIT3和HMGA2的共扩增，因此目前推荐使用”GLI1改变的间叶性肿瘤”命名。少数类似病例中报道过GLI2融合基因。
组织学特征从相对单一的卵圆形/梭形细胞肿瘤，到具有多结节结构及片状/巢状/条索状排列的上皮样病变均可出现。其他病例可表现为原始圆形细胞形态或明确恶性多形性特征。双相型模式（含上皮/上皮样细胞）见于胃母细胞瘤。多核巨细胞可能并存。血管外皮瘤样血管结构常见于梭形细胞病变，肿瘤巢突入管腔的模式类似肌纤维瘤/肌周皮瘤。
免疫组化表现具有异质性（部分与特定细胞类型相关，如上皮样细胞表达角蛋白），可能造成误导。但已证实GLI1免疫组化可作为常见GLI1相关病变的替代标记物。本研究通过RNA表达和DNA甲基化水平的聚类分析，描述8例GLI（通路）改变病变的临床病理和分子特征，以证实这些病变的关联性。
材料与方法
8例病例选自作者（会诊）档案库，所有病例均复查HE切片并获得完整临床资料。样本处理遵循荷兰《人体组织二次使用伦理准则》，采用编码（匿名化）方式，经当地机构IRB批准。
文献检索聚焦于GLI改变间叶性肿瘤家族的临床病理、遗传及表观遗传特征。
免疫组化
4μm厚FFPE切片经56℃烘烤10分钟后，使用Ventana全自动染色仪（BenchMark Ultra, Roche）检测。抗体包括：S100（即用型，4C4.9, Roche）、SOX10（即用型，EP268, Roche）、CD56（即用型，CD564, Leica）、嗜铬粒蛋白（即用型，5H7, Leica）、突触素（即用型，27G12, Leica）、MDM2（IF2, 1:40, Cell Marque）、CDK4（DCS-31, 1:400, Cell Marque）、CKAE1/3（即用型，AE1/AE3, Leica）、EMA（即用型，GP1.4, Leica）、STAT6（即用型，EP325, Cell Marque）及CD99（PCB1, 1:40, Leica）。预处理按标准流程进行。
分子分析
靶向mRNA测序
使用Maxwell RSC 48系统（Promega）和RNA FFPE试剂盒提取RNA，250ng RNA经Archer FusionPlex Lung Kit构建cDNA文库，Ion S5测序仪（Thermo Fisher）测序，Archer分析软件（v6.0）分析数据。
全转录组测序（mRNA测序）
QiaCube（Qiagen）平台按标准流程采用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit提取RNA（病例6用新鲜冻存组织，病例1-5用FFPE样本）。300ng RNA经KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase（Roche）建库，NovaSeq 6000系统（2×150bp, Illumina）测序。数据通过GATK 4.0最佳实践流程分析，包括FastQC（v0.11.5）质控、Picard（v2.20.1）RNA指标输出、MarkDuplicates。原始数据经STAR（v2.7.0f）比对至GRCh38和Gencode v29。
全外显子测序（WES）
QiaCube平台采用AllPrep试剂盒提取DNA，150ng DNA经KAPA HyperPrep Kit结合HyperExome捕获试剂盒（Roche）建库，NovaSeq 6000系统（2×150bp, Illumina）测序。肿瘤与正常样本（血液DNA）数据通过GATK 4.0最佳实践流程分析，包括Fastqc（v0.11.5）质控、Picard（v2.20.1）DNA指标输出、MarkDuplicates。体细胞单核苷酸变异（SNVs）通过Mutect2（GATK 4.1）检测，致病性经VEP（v92）预测。
体细胞拷贝数变异（CNAs）通过GATK4流程分析，使用同条件下制备测序的正常样本构建”panel of normals”（PON）进行标准化。等位基因失衡率基于1000 Genomes中MAF>0.1的常染色体SNP位点计算。
甲基化谱分析（含拷贝数变异分析）
采用NorDiag Arrow（DiaSorin DNA提取试剂盒）或GeneRead DNA FFPE Kit（Qiagen）提取DNA，Qubit 2.0定量。每样本使用500ng（DK）或200ng（NL）DNA，经EZ DNA Methylation™ Kit（Zymo Research）进行亚硫酸盐转化。Illumina MethylationEPIC（850k）BeadChip平台生成数据。样本经海德堡肉瘤分类器（v12.2）分类，minfi包改进版处理数据，R 4.6.1分析。
荧光原位杂交（FISH）分析
病例8行MDM2双色FISH检测。FFPE切片使用MDM2-CEN12双色扩增探针（Z-2013; ZytoVision），计数至少100个细胞核。MDM2扩增标准为MDM2/CEN12比值>2或MDM2拷贝数>4。
结果
临床特征（表1）
8例肿瘤来自7女1男，年龄15-82岁（中位40岁）。肿瘤位于卵巢（3例）、子宫内膜（1例）、腹膜后（1例）、大腿皮肤（1例）、胸锁乳突肌（1例）及下咽（1例）。肿瘤大小0.6-14cm（平均6.0cm），随访时间0-31个月（中位21.5个月）。3例发生转移：1例双肺转移（病例1），1例腹膜及肝转移（病例4），1例初诊即伴肺、胸膜、骨、腹部及软组织多发转移（病例8）。2例卵巢肿瘤患者出现局部扩散（病例3和5）伴腹腔内蔓延，其中1例因原发瘤破裂导致（病例3）。3例（病例2、3、7）分别在25、31和18个月后无病生存。病例1、4、8分别于诊断后3、27和5个月死亡。2例（病例5和6）无随访数据。
组织病理学（表2及图1-2）
下咽与皮肤肿瘤（病例1和7）分别位于上皮下间质和真皮层，表面隆起呈不规则结节。子宫病变（病例4）呈息肉样，局限于子宫内膜并包绕原有腺体（图1e）。卵巢肿瘤表现为境界清楚的间质内结节（病例3）、表面息肉样（病例6）或浸润小骨盆周围结构（病例5）。胸锁乳突肌与腹膜后软组织肿瘤呈结节状/膨胀性（病例2）或浸润性生长（病例8）。
2例（病例1和4）以上皮样细胞为主，呈片巢状及假腺样排列，核圆至卵圆形伴轻度多形性，染色质空泡状，可见小核仁，未见核分裂。胞质两性染色伴局部收缩形成单泡状脂肪母细胞样，细胞膜清晰（图1f）。病例2呈胃母细胞瘤样双相形态，上述单形性上皮样细胞逐渐过渡为无结构梭形细胞成分（图1a-b），后者核细长、大小形态略异，染色质均匀，胞质不明显，未见核分裂，背景为疏松胶原纤维（图1a-b）。
病例3和5呈黏液样脂肪肉瘤样表现，多结节结构伴细胞密度不均及显著黏液样背景（图1c），细胞核圆至卵圆形，染色质空泡状伴小核仁，无核分裂，胞质稀少两性染色，散在胞质收缩及黏液空泡形成的假脂肪母细胞（图1d）。病例6呈多结节结构，梭形细胞模糊束状排列，卵圆形核伴空泡状染色质及小核仁，胞质不可辨，无核分裂（图2a-b），部分特征类似丛状纤维黏液瘤。
病例7皮肤肿瘤细胞丰富，主要由圆形细胞构成，染色质空泡状伴小核仁，胞质稀少，核分裂象7个/10HPF。病例8为弥漫增殖的多形性上皮样肿瘤细胞，核分裂活跃伴非典型核分裂（图1h）。所有病例均见纤细分支血管网，病例2、5、6另见血管外皮瘤样血管。病例1和8出现肿瘤坏死（图1g）。
免疫组化结果（表2）
2/6例S100阳性（其中1例SOX10阴性），另2例未染S100者SOX10阴性。5例中2例广谱角蛋白（AE1/3）和EMA部分阳性（1例共表达）。MDM2/CDK4与STAT6分别在1/2例和1/3例中阳性，与对应基因扩增相关。3/3例CD56阳性，SYN与CgA分别在1/4例和1/3例中局灶阳性。病例7部分细胞CD99胞质阳性。
分子结果（详见表2）
2例携带GLI1::MALAT1融合（病例2和3），1例检出PTBP1::GLI2融合（病例5）。3例（病例1、4和7）存在GLI1扩增，其中病例1和4伴MDM2/CDK4共扩增。病例8显示GLI2扩增（位于2q14），但NGS和FISH未检测到MDM2/CDK4扩增。病例6存在PTCH1功能缺失突变而非GLI1/2改变。
基于RNA表达分析，7例受检病例中有5例（包括携带PTCH1突变的病例6）聚类为GLI改变间叶性肿瘤组。
甲基化谱分析涵盖7/8例（排除病例5）。热图层次聚类显示这7例病例与其他实体/组织学相似病变（如尤文肉瘤、BCOR改变肉瘤、CIC重排肉瘤、血管平滑肌瘤/肌周皮瘤、黑色素瘤、黏液样脂肪肉瘤、高分化/去分化脂肪肉瘤、孤立性纤维性肿瘤及滑膜肉瘤）分离（图3），表明GLI改变肿瘤基于相似甲基化谱具有表观遗传同源性。
除病例1和4的GLI1/2及MDM2/CDK4扩增外，其余病例拷贝数谱基本平坦。病例8则呈现多发性增益/缺失但无MDM2/CDK4扩增。
图1 形态学特征（H&E染色）
a、b（病例2）：可见双相型结构，由上皮样细胞巢片状排列逐渐过渡为梭形细胞成分（类似胃母细胞瘤）（×10和×32倍）。
c、d（病例3）：类似黏液样脂肪肉瘤的原始圆形及梭形细胞分布于黏液样间质中，可见纤细”鸡笼”样血管网（×8和×20倍）。
e、f（病例4）：子宫内膜肿瘤呈息肉样，上皮样细胞呈片巢状排列（×1和×25倍）。
g、h（病例8）：多形性上皮样肿瘤细胞主要呈片状分布，核分裂活跃（h），可见肿瘤坏死（g右侧）（×8和×20倍）。
图2 病例6形态学特征（H&E染色）
a、b：携带PTCH1突变的病例6可见单形性梭形细胞多结节性增生，呈模糊束状排列（×8和×25倍）。
图3 甲基化谱热图显示GLI改变病例独立成簇，与其他实体/组织学相似病变分离，证实其为独立肿瘤类别。
讨论
当HH配体与跨膜受体Patched 1（PTCH1）结合后，原本抑制7次跨膜G蛋白偶联受体Smoothened（SMO）活性的作用被解除，从而激活HH信号通路。这导致GLI锌指转录因子从SUFU蛋白的胞质禁锢中释放，进而转位至细胞核调控靶基因转录。三种蛋白亚型中，GLI1主要发挥转录激活作用，而GLI2和GLI3兼具激活与抑制功能。
GLI1/2改变已见于多种软组织肿瘤（表3），包括伴t(7;12)的血管外皮细胞瘤、胃母细胞瘤和丛状纤维黏液瘤（后两者主要发生于胃部）。GLI1/2重排多导致启动子替换，使融合基因高表达且保留DNA结合锌指结构域，从而异常激活下游靶基因。本研究中2例携带常见MALAT1::GLI1融合（1例胸锁乳突肌双相型胃母细胞瘤样肿瘤，1例卵巢黏液样脂肪肉瘤样病变），后者与Miettinen和Saoud报道病例相似。另1例卵巢肿瘤检出PTBP1::GLI2融合，为罕见GLI2融合新增伙伴基因。GLI2较少受累可能与其抑制功能有关，但分析偏倚不能排除。
GLI1/2扩增同样导致mRNA/蛋白过表达。本组3例GLI1扩增（2例伴MDM2/CDK4共扩增），1例腹膜后肿瘤存在首次报道的GLI2扩增（其他肿瘤中已有GLI2异常报道）。近期38例研究提示GLI1扩增肿瘤因mRNA过表达更显著，预后较融合型更差。本组3/4例GLI1/2扩增患者死亡，但浅表部位（皮肤）肿瘤预后良好，表明GLI表达水平与侵袭性相关，但共扩增基因可能协同影响预后。
值得注意的是，与其他HH通路成员（HH、PTCH1、SMO、SUFU）突变不同，GLI突变不直接激活HH通路。本组1例卵巢肿瘤携带PTCH1功能缺失突变，与丛状纤维黏液瘤中PTCH1缺失的报道一致，提示诊断时需考虑HH通路其他成员的改变。
RNA表达与DNA甲基化分析显示，包括PTCH1突变病例在内的大多数样本聚为一类，证实GLI改变或HH通路异常的间叶性肿瘤属于同一疾病实体。最新多组学研究也支持这一结论。除1例高度恶性病例外，其余拷贝数变异（CNV）谱平坦，但2例GLI1扩增伴转移表明CNV不能单独预测生物学行为。本组数据显示高龄合并GLI扩增是不良预后因素，而年轻患者（多为融合型）和浅表肿瘤预后较好。
形态学谱系方面，肿瘤可表现为：
①上皮样/梭形细胞（常无非典型性，含1例胃母细胞瘤样双相型病变）；②原始圆形-卵圆形细胞（胞质空泡化可类似黏液样脂肪肉瘤）；核分裂通常稀少。这与文献报道的GLI1/2改变肿瘤异质性一致（表3），包括上皮表型及罕见多形性病例。本组未发现形态与预后的明确关联，但肿瘤≥6cm、核分裂≥5/10HPF和坏死可能提示转移风险，因缺乏明确恶性标准需谨慎评估。
免疫组化可能造成误导：
MDM2/CDK4和STAT6共扩增可模拟去分化脂肪肉瘤/孤立性纤维性肿瘤；
广谱角蛋白/EMA阳性需与（肌）上皮肿瘤鉴别；
CD56/SYN/CgA共表达易误诊为神经内分泌肿瘤。
其他鉴别诊断包括：尤文肉瘤（原始形态+CD99）、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、血管周细胞肿瘤、黏液样脂肪肉瘤（DDIT3可能阳性）、上皮样血管内皮瘤、软组织血管纤维瘤、非骨化性纤维黏液瘤及黑色素瘤等。
近期研究表明，GLI1免疫组化（融合型多胞质染色，扩增型多核染色）是筛查GLI1改变的有效辅助手段，但可能漏检GLI2过表达或PTCH1突变病例，且需注意去分化脂肪肉瘤等肿瘤的GLI1共扩增。
结论：本研究拓展了对GLI相关改变间叶性肿瘤的认知，证实其具有广谱临床病理和遗传学特征（含GLI2扩增、新型GLI2::PTBP1融合及PTCH1失活突变）。高龄患者GLI1/2扩增肿瘤侵袭性强，而年轻患者（融合型）即使转移仍呈惰性病程。未来需进一步研究以优化治疗策略和预后预测体系。
Hiemcke-Jiwa LS, van Ewijk R, van Noesel MM, Tops BBJ, Koppes SA, Lubeek SFK, Jonges GN, Witkamp AJ, von Deimling A, Cleven AHG, Kester LA, Flucke U. GLI1/2-altered mesenchymal tumors: a study of 8 cases expanding the clinicopathological and molecular spectrum including an upstream PTCH1-inactivating mutation. Virchows Arch. 2025 Aug 14. doi: 10.1007/s00428-025-04211-5. Epub ahead of print. PMID: 40813503.