肠道微生物群-胆汁酸轴在阿司匹林介导的损伤后促进肠道平衡
研究论文
● 原文: Cell Host & Microbe(IF 20.6)
●原文链接：https://www./cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(23)00510-3
● DOI: https:///10.1016/j.chom.2023.12.015
● 第一作者：Ting Li; Ning Ding; Hanqing Guo
● 通讯作者：Zuyi Yuan (袁祖贻) (zuyiyuan@mail.); Frank J. Gonzalez (gonzalef@mail.); Yue Wu(吴岳) (wu.yue@)
● 主要单位：西安交通大学第一附属医院心血管内科;西安交通大学西安市中心医院消化内科;()西京消化病医院
阿司匹林（Aspirin）相关的胃肠道损伤日益受到关注。阿司匹林的使用会调节肠道菌群及其相关代谢物（如胆汁酸），但这一影响如何干扰肠道稳态尚不明确。本研究通过临床队列和阿司匹林处理的小鼠模型，鉴定出一种受阿司匹林抑制的肠道微生物-金/戈/古氏副拟杆菌（Parabacteroides goldsteinii）。补充金氏副拟杆菌或其胆汁酸代谢产物7-酮基石胆酸（7-keto-LCA）的小鼠，其阿司匹林介导的肠道生态位损伤和肠屏障破坏显著减轻；而无法产生7-酮基石胆酸的金氏副拟杆菌hdhA突变株则无此保护作用。机制上，7-keto-LCA通过抑制肠道胆汁酸受体法尼醇X受体（FXR）的信号传导，促进肠上皮修复。研究证实7-酮基石胆酸是一种FXR拮抗剂，可激活Wnt信号通路，从而促进肠道干细胞自我更新。这些结果系统揭示了口服Asp通过影响肠道菌群及胆汁酸代谢，进而调节胃肠道稳态的作用机制。
阿司匹林在人类和小鼠中诱导肠道菌群失调
从 23 名健康志愿者处收集了连续服用100毫克Aspirin 30天前和后（服用前为 BA，服用后为 AA）的粪便样本（Fig 1A）。然后进行粪便宏基因组分析发现，阿司匹林治疗后，肠道菌群组成发生了显著变化(Fig 1B)。此外人群肠道菌群的VIP评分(Fig 1C)，表明AA组副拟杆菌含量下降，此外，种共现网络分析(Fig 1D)和种丰度比较(Fig 1E, Fig 1F)也证实了拟杆菌属的肠道细菌减少，这些结果表明经Aspirin处理后，肠道中拟杆菌属细菌减少。然后测定了主要物种的丰度，发现戈氏副拟杆菌（P. goldsteinii）、粪拟杆菌（P. merdae）和双歧拟杆菌（P. distasonis）均有所减少（Fig 1G），另一个数据库中，阿司匹林处理后，P. goldsteinii 的丰度也显著降低，这些结果表明经阿司匹林处理后，P. goldsteinii减少。
然后进行小鼠实验验证，用Aspirin灌胃小鼠14天，发现小鼠口服阿司匹林改变了肠道微生物组成(Fig 1H)、α-多样性(Fig 1I)和P. goldsteinii丰度随时间增长而降低 (Fig 1J)，这些结果表明，阿司匹林在人类和小鼠中均诱导肠道菌群失调，其特征为P. goldsteinii丰度降低。
图1. 阿司匹林处理改变人体肠道菌群并显著降低拟杆菌属丰度
Fig 1A接受阿司匹林治疗的健康志愿者队列（BA-AA队列）。分别在给药前（BA组）和口服阿司匹林（100 mg/d）后30天（AA组）收集粪便样本，进行宏基因组测序。
Fig 1B基于相对属丰度的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。N = 23个人/组。
Fig 1C PLS-DA的VIP （Variable importance in projection）评分显示了不同类群区分类群的能力。VIP评分为bbbb1.5的分类单元被认为重要的。
Fig 1D基于BA和AA组核心属（数量最多的前50个属）的肠道微生物共生网络分析。连接线表示绝对值Spearman等级相关系数> 0.30。
Fig 1E BA组和AA组肠道菌群的相对丰度。红色: Parabacteroides
Fig 1F前12个属的相对丰度比较，BA和AA组间差异最显著。
Fig 1G基于宏基因组学结果的Parabacteroides属不同物种的相对丰度。N = 23个人/组。
Fig 1H Top: C57BL/6J小鼠给予阿司匹林（饮用水中2 mg/mL [11.1 mM]）治疗2周，收集粪便进行16S测序（n = 6/组）。下图为16S测序的PLS-DA （n = 6/组）（阿司匹林 0天和阿司匹林 14天）。
Fig 1I小鼠粪便微生物群多样性3项指标（阿司匹林 0 d vs. 阿司匹林 14 d）。
Fig 1J阿司匹林治疗后不同时间点小鼠肠道菌群丰度前10种的丰度。
阿司匹林损害肠道屏障功能并引起肠道损伤
为了进一步确定P. goldsteinii在阿司匹林干扰肠道稳态中的重要性，评估了用阿司匹林治疗的小鼠的肠道损伤评分，损伤评分随抗生素使用的种类和时间的上升而上升(Fig 2A)。戈氏副拟杆菌的丰度与肠道损伤的严重程度呈负相关。然后进行了肠道内容物的16s分析、肠道菌群差异热图(Fig 2B)和PCA图(Fig 2C)表明，阿司匹林和新霉素处理后肠道菌群存在差异。阿司匹林和新霉素处理后抑制了SPF小鼠中的戈氏副拟杆菌(Fig 4D)，结果表明阿司匹林处理后，小鼠肠道受到损伤且菌群结构发生变化。紧接着进行了PAS染色等实验，发现PAS染色显示，阿司匹林和新霉素处理后肠道黏膜变薄(Fig 2F)、杯状细胞分化受抑制以及隐窝细胞增殖减少(Fig 2E)。此外阿司匹林和新霉素处理后增加了肠道通透性(Fig 2G)，肠道出血率增加(Fig 2H)，进一步验证阿司匹林处理后，小鼠肠道受到损伤。
然后进行了tunel检测，发现TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）检测发现，阿司匹林和抗生素治疗导致细胞凋亡(Fig 2I)、此外进行了LC-MS实验，检测了血浆和肠道的阿司匹林水平，发现阿司匹林生物利用度无差异，通过透射电镜发现，通过TEM发现，阿司匹林治疗后肠道屏障受损(Fig 2J)，最后，肠道组织中紧密连接蛋白 ZO-1 和 claudin-5 水平降低(Fig 2K)，验证小鼠肠道损伤与阿司匹林处理有关。
图2.阿司匹林通过改变菌群结构及抑制金氏副拟杆菌引发肠道损伤
Fig 2A C57BL/6J小鼠口服阿司匹林治疗2周，方法是在饮水中加入浓度为2mg /mL （11.1 mM）的阿司匹林，不含抗生素（新霉素[新霉素]）。示出各组肠道H&E染色及损伤评分的代表性图像。的随机10个位置，选取小鼠远端空肠，取平均评分（n = 10个重复/组）。比例尺，200毫米。
Fig 2B经Aspirin处理的小鼠肠道内容物中不同物种的热图。
Fig 2C四组小鼠肠道内容物16S测序结果PCA。
Fig 2D基于16S测序结果的P. goldsteinii的相对丰度。N = 5/组。
Fig 2E和Fig 2F小鼠远端空肠Ki67 (E)和周期性酸-希夫（PAS，F）染色。肠隐窝（红点）Ki67染色定量比较绒毛PAS染色（n = 10/组）。随机抽取一个样本的二十个点，取每只老鼠的平均值被计算为一个单点。
Fig 2G使用二胺氧化酶（DAO）（左）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（中）和脂多糖（LPS）进行肠通透性分析(右)。N = 5个/组。
Fig 2H四组小鼠粪便标本粪便潜血试验（FOBT）。N = 15个/组。
Fig 2I肠道TUNEL染色的代表性图像。给出了隧道平均正面积的统计分析。N = 5个/组。20个随机取一个样本的点，每只老鼠的平均值作为一个单点计算。
Fig 2J经Aspirin处理的小鼠肠道组织透射电镜（TEM）。显示了5只小鼠中1只的代表性图像。绿色箭头指向完整的细胞-细胞连接，红色箭头指向破坏的细胞连接。比例尺，5毫米。
Fig 2K Aspirin处理小鼠肠组织中ZO-1和claudin5 mRNA水平。n = 5个重复/组。靶基因mrna的表达归一化。
金氏副拟杆菌被阿司匹林消耗并恢复胆汁酸谱
首先研究发现阿司匹林处理的戈氏副拟杆菌的生长受到了剂量依赖性抑制(Fig 3A)，进行代谢组分析发现阿司匹林处理组富含与氨基酸代谢相关的化合物，L-谷氨酰胺、瓜氨酸和 L-脯氨酸被发现是相互作用网络的核心成分(Fig 3B)并且得到验证，此外，补充 L-谷氨酰胺和柠檬黄氨酸可以缓解阿司匹林对P. goldsteinii生长的抑制(Fig 3C)，表明阿司匹林可能通过干扰这两种代谢物的生物合成来影响P. goldsteinii。
对小鼠的肠道内容物进行非靶代谢组分析发现，阿司匹林处理后肠道胆汁酸库减少(Fig 3D)，灌胃P. goldsteini可使其恢复(Fig 3E)，阿司匹林显著降低了肠道中牛磺酸α/β-熊去氧胆酸、UDCA和 7-keto-LCA 的浓度，灌胃P. goldsteinii可使其恢复(Fig 3F)，P. goldsteinii的丰度与胆汁酸的丰度呈正相关(Fig 3G)说明P. goldsteinii与胆汁酸代谢相关，此外对人群的粪便进行非靶代谢组分析，人群粪便代谢物谱表现阿司匹林处理降低胆汁酸库和戈氏副拟杆菌丰度(Fig 3H、Fig 3I)，可通过其他数据库验证，说明戈氏副拟杆菌在调节胆汁酸模式方面具有生物活性作用。
我们对 BA-AA 队列的宏基因组数据进行了进一步分析，发现hdhA 基因（编码 7-α-HSDH）的拷贝数在阿司匹林处理后显著减少（Fig 3J），然后预测了胆汁酸代谢的合成途径(Fig 3K)，hdhA 编码的7α羟基类固醇脱氢酶能够在体内和体外将 CDCA（鹅去氧胆酸） 转化为 7-keto-LCA（7-keto-石胆酸）和UDCA（熊去氧胆酸）及 βMCA（鼠胆酸），通过单菌基因组分析，在拟杆菌中发现与 hdhA 同源的序列，包括P. goldsteinii、P. merdae和P. distasonis (Fig 3L)，通过对培养上清的检测，发现P. goldsteinii在体外产生 7-keto-LCA 而非UDCA (Fig 3M)，通过代谢组分析还发现肠道内容物和粪便样本中胆汁酸浓度之间存在良好相关性，在代谢组中还发现P. goldsteinii增加了 TβMCA 的浓度, 这可能是因为胆汁酸池中总 MCA 的总量增加，而BSH（胆盐水解酶）活性没有变化(结果见附图)，这些结果证明P. goldsteinii恢复了肠道胆汁酸谱的稳态。
图3.阿司匹林通过干扰氨基酸代谢通路直接抑制金氏副拟杆菌生长
Fig 3A阿司匹林浓度为0 ~ 4 mmol/L （0.18 ~ 0.72 mg/mL）时，P. goldsteinii生长曲线。N = 6个重复/组。所有统计分析分别在各组之间进行，阿司匹林设置在0 mM（黑色）。
Fig 3B基于代谢组学数据的代谢物富集通路和网络，这些数据来自加或不加阿司匹林的P. goldsteinii培养基。蓝色的框架:不同的代谢产物。红线：代谢途径正相关；蓝线：代谢途径负相关。
Fig 3C阿司匹林和补充氨基酸对P. goldsteinii生长的响应曲线。阿司匹林浓度：4 mmol/L。N = 6个重复/组。所有的统计分别与阿司匹林组（红色）进行分析。
Fig 3D左：给小鼠补充P. goldsteinii（1×10^8 CFU/0.2 mL，3次/周）2周，同时或不同时口服阿司匹林（2 mg/mL [11.1 mM]）再过两个星期。肠道内容物进行代谢组学分析。N = 8个/组。右：胆汁酸浓度。
Fig 3E显示各组中不同胆汁酸的平均百分比。整个环的面积表示总胆汁酸的浓度。
Fig 3F不同组小鼠肠道内容物中Ta/bMCA、7-keto- lca、UDCA的浓度。
Fig 3G阿司匹林处理小鼠和对照小鼠肠道菌群丰度与肠道胆汁酸水平相关性热图。
Fig 3H图1A中BA-AA队列粪便中不同胆汁酸的浓度。
Fig 3I BA-AA队列粪便样本中7-keto-LCA和UDCA浓度与P. goldsteinii丰度的相关性。样品中含有低丰度(<10)被排除在外。
Fig 3J图1A中BA-AA队列个体中微生物群中7-a-羟基类固醇脱氢酶（hdhA）基因的丰度。N = 23， 个人/组。
Fig 3K人和小鼠BA的合成途径。在人和小鼠的肠道中，UDCA和7-酮- lca是由CDCA的肠道菌群产生的，使用hdhA。小鼠用肝细胞生成的6b-羟化酶将CDCA与牛磺酸偶联合成胆酸（MCA）。
Fig 3L使用PacBio Sequel和Illumina MiSeq测序仪测定了Parabacteroides中几个物种的基因组序列。图中显示了这些物种中含有hdhA的基因簇。
Fig 3M P. goldsteinii (OD = 0.1)体外培养中分别添加CA、CDCA、LCA和UDCA。分析培养基中胆汁酸的浓度。图中为7-keto- LCA和UDCA的浓度。N = 3个重复/组。
金氏副拟杆菌通过hdhA改善阿司匹林引起的肠道及FXR的作用
首先构建了hdhA缺陷型P. goldsteinii突变株（PG∆hdhA）(见附图)。通过P. goldsteinii-CDCA共培养上清LC-MS分析，LCMS 分析突变株无法将 CDCA 转化为 7-keto-LCA，绘制hdhA 缺陷型P. goldsteinii突变株的生长曲线发现，hdhA 对P. goldsteinii的生长没有影响，PG∆hdhA 并未影响其对宿主的定植(结果见附图)，紧接着进行了小鼠实验，用活菌、灭活菌、野生型和hdhA 基因敲除型P. goldsteinii进行灌胃发现，只有活P. goldsteinii (LPG)和野生型P. goldsteinii (PGwt)，改善了损伤评分(Fig 4A)，此外，只有LPG 和 PGwt 恢复了肠道通透性(Fig 4B)，LPG 和PGwt逆转了阿司匹林引起的肠道粘液屏障损伤(Fig 4C)，并保护杯状细胞(Fig 4D)，LPG 和 PGwt 保护了肠道上皮细胞(Fig 4E 、Fig 4F)，HPG组具有强大的紧密连接，LPG 组中发现受损(Fig 4G)携带 hdhA 基因的P. goldsteinii可以缓解肠道损伤。
UDCA 和7-keto-LCA 保护阿司匹林引起的肠道上皮损伤(Fig 4H)、保护肠道通透性(Fig 4I)、保护肠道粘液屏障(Fig 4J)、杯状细胞和缓解阿司匹林诱导的损伤(Fig 4K、Fig 4L)，有助于维持紧密连接，灌胃UDCA和7-keto-LCA ，提高紧密连接标志物的 mRNA 水平(Fig 4M)，这些结果证明P. goldsteinii和hdhA 产生的胆汁酸能够保护免受阿司匹林诱导的肠道损伤。
图4.金氏副拟杆菌通过其hdhA基因介导的胆汁酸代谢发挥肠道保护作用
Fig 4A补充活的P. goldsteinii （LPG）、热杀的P. goldsteinii（HPG）、野生型P. goldsteinii（PGwt）或缺乏hdhA的P. goldsteinii（PGDhdhA） (1×10^8 CFU/0.2 mL，3次/周)灌胃小鼠2周，联合或不联合口服阿司匹林（2 mg/mL [11.1 mM]）再灌胃2周。图中显示了各组H&E染色小肠的代表性图像和损伤评分。随机选取10个小鼠远端空肠部位，计算平均得分（n = 10个重复/组）。比例尺，200毫米。
Fig 4B肠通透性分析使用DAO（左），FITC标记的葡聚糖（中）和LPS（右）。N = 5个/组。
Fig 4C和Fig 4D PAS染色显示各组的代表性图像（左）和粘膜厚度(D)和PAS阳性杯状细胞的统计分析（右）(C). n = 10个人/组。
Fig 4E小肠TUNEL染色，随机选取10个小鼠远端空肠部位。N = 5个人/组。
Fig 4F FOBT使用(A)处理的小鼠粪便样本，n = 15个重复/组。
Fig 4G用LPG或HPG处理的阿司匹林小鼠肠道屏障结构代表性图像。绿色箭头指向完整的细胞-细胞连接处在电子显微镜下，红色箭头指向被破坏的细胞连接。黄色虚线为凋亡细胞。
Fig 4H给小鼠补充UDCA和7-keto- LCA 2周，再加或不加口服阿司匹林（2 mg/mL [11.1 mM]） 2周。代表性的图片，显示各组H&E染色肠的病理变化及损伤评分。随机选取远端空肠10个部位，计算其平均得分小鼠（n = 10重复/组）。比例尺，200毫米。
Fig 4I使用DAO（左）、FITC标记的葡聚糖（中）和LPS（右）进行肠通透性分析。N = 5个/组。
Fig 4J和4K处理小鼠肠组织PAS染色（n = 10个重复/组）和TUNEL+面积（n = 5个重复/组）。
Fig 4L FOBT采用(H)处理的小鼠粪便样品，n = 15个重复/组。
Fig 4M小鼠肠组织中肠紧密连接标志物的相对mRNA水平，左为ZO-1，右为claudin-5。N = 5个/组。
FXR是一种胆汁酸受体，在肠干细胞增殖和肠道屏障中起关键作用，为了验证FXR在肠道损伤中起到的作用。首先构建了FXR肠道特异性敲除的小鼠模型(见附图)，FXR缺失小鼠经阿司匹林处理后，表现出减轻的肠道损伤(Fig 5A)、肠道屏障破坏(Fig 5B)、生长抑制(Fig 5C)、细胞凋亡(Fig 5D)、黏膜厚度(Fig 5E)、杯状细胞减少(Fig S8C)和阿司匹林引起 FOBT率(Fig S8D)的效果。在免疫荧光染色的过程中，阿司匹林处理后，FXR 基因敲除可以减少β-catenin和Olfm4隐窝细胞胞核分布数量(Fig 5F)，增加增加杯状细胞和潘氏细胞的数量(Fig 5G)，综上，FXR 部分介导了阿司匹林对肠道的效应。
Fxr缺失的小鼠通过 16S 测序分析了肠道内容物发现阿司匹林改变了Fxr缺失使小鼠的微生物群落组成，且P. goldsteinii丰度下降(结果见附图)，说明P. goldstenii的减少是由阿司匹林诱导的，而不是肠道损伤的结果，综合上述结果综上，FXR 部分介导了阿司匹林对肠道的效应。
图5.肠道上皮FXR信号通路介导阿司匹林诱导的肠道损伤
Fig 5A用阿司匹林（饮用水中2 mg/mL [11.1 mM]）治疗2周，肠道特异性敲除fxr -小鼠（FxrΔIE）和对照基因型小鼠（Fxrfl/fl）以及每组的肠道损伤评分。N = 10个/组。比例尺，200毫米。
Fig 5B肠通透性分析。N = 5个/组。
Fig 5C到Fig 5E 阿司匹林处理小鼠肠道Ki67、TUNEL和PAS染色。(C)和(D)中n = 5个重复/组，(E)中n = 10个重复/组。每个点表示每只小鼠10个随机视觉或绒毛和隐窝的平均值。
Fig 5F小鼠肠隐窝中b-catenin和Olfm4的免疫组化（IHC）。n = 10个重复/组。白色箭头标记细胞隐窝核表达b-连环蛋白。
Fig 5G小鼠肠绒毛和隐窝中mucin2和溶菌酶的表达，分别标记杯状细胞和Paneth细胞。N = 10个重复/组。白色箭头表示溶菌酶表达的隐窝细胞。每一个点代表每只老鼠20个随机绒毛或隐窝的平均值。
金氏副拟杆菌通过调节胆汁酸代谢促进肠道自我更新
首先P. goldsteinii可以延缓阿司匹林抑制肠道微环境中的细胞增殖(Fig 6A)，P. goldsteinii可以抑制从原代分离的隐窝培养的肠道类器官在阿司匹林处理的小鼠中表现出减少的扩增、分节数和表面积(Fig 6B)。
为了研究P. goldsteinii 对肠道干细胞的影响，开发了一种细菌和类器官共培养装置并测量了氧浓度（Fig 6C）并在该系统中，评估了P. goldsteinii 的活力(Fig S9A)，此外发现P. goldsteinii 促进类器官生长(Fig 6D)，活的戈氏副拟杆菌增强类器官增殖能力和降低凋亡百分比(Fig 6E) ，活的戈氏副拟杆菌处理类器官，其中杯状细胞和潘氏细胞的数量也有所增加(Fig 6F)，干细胞标志物 mRNA（如 Lgr5、Olfm4 和 Ascl2）以及肠道通透性标志物 mRNA 的含量增加(Fig 6G)
然后进行了类器官-CDCA-类器官三者共培养发现，UDCA和 7-keto-LCA都消除了阿司匹林对原代细胞增殖的抑制作用(Fig 6H)，经 BA 处理的小鼠细胞的生长和干细胞扩增得到了恢复(Fig 6I)，UDCA 和 7-keto-LCA 在体内补充时，杯状细胞和潘氏细胞的数量都增加(Fig 6J)，HT-29 中UDCA 和 7-keto-LCA 对阿司匹林诱导的肠道损伤的抗凋亡和增殖功能有所缓解，未添加 CDCA 的共培养系统中类器官生长、凋亡和分化无显著差异(结果见附图)，这些结果表明P. goldsteinii及其胆汁酸代谢物有助于在肠道自我修复过程中维持肠道干细胞功能。
图6. 金氏副拟杆菌及其胆汁酸代谢物通过维持肠道干细胞功能促进上皮修复
Fig 6A处理小鼠远端空肠Ki67和5-乙基-20-脱氧尿苷（EdU）染色。P. g：活P. goldsteinii。红/白虚线表示单个肠道隐窝。随机抽取一个样本的10个点，每只老鼠的平均值计算为一个单点。红、EdU; 蓝色, DAPI。N = 10个/组。
Fig 6B用(6A)处理的小鼠的隐窝培养肠道类器官。形成率由类器官/隐窝比值计算。苗头的标志是红色的三角形。每只老鼠产生的类器官的十个随机影像被挑选出来，并显示了五个生物重复的数据。
Fig 6C肠道类器官与厌氧菌相互作用的共培养系统描述。24 h测量O2浓度组装之后。上培养基中添加浓度为10 mM的CDCA。
Fig 6D与C57BL/6J小鼠的次级肠道类器官共培养4天，比较了类器官的形成率、出芽数和面积。N = 10个生物重复/组。
Fig 6E类器官与HPG或LPG共培养后的EdU（上组）和TUNEL（下组）染色。白色虚线表示单个类器官。红色:EdU; 绿色:TUNEL; 蓝色:DAPI。N = 20个生物重复/组。
Fig 6F Mucin2和溶菌酶的免疫荧光。红色：Mucin2 (Muc2)；黄色：溶菌酶（Lyso）；蓝色:DAPI。N = 20个生物重复/组。白色箭头类器官表面细胞呈阳性染色。
Fig 6G共培养后，通过RT-qPCR检测编码干细胞标记物和通透性标记物的mrna的类器官水平。
Fig 6H小鼠在服用阿司匹林的同时补充UDCA和7-酮- lca，见图4H。提取肠隐窝和初级类器官体外培养，显示类器官的代表性图像（左）。分析了类器官的形成速率、出芽数量和面积（右）。N = 10复制/组。
Fig 6I (6H)处理小鼠产生的类器官的EdU（左）和TUNEL（右）染色统计分析。n = 20个生物重复/组。
Fig 6J (6H)处理后小鼠肠绒毛和隐窝中粘蛋白2（绿色）和溶菌酶（红色）的染色。每个点代表30个随机绒毛的平均值或者每只老鼠都有隐窝。白色箭头表示潘氏细胞。N = 10个/组。
产7-keto-LCA的金氏副拟杆菌是一种 FXR 拮抗剂，可促进Wnt信号通路
7-keto-LCA 被对接到人类 FXR 配体结合域(PDB：3DCT，R4), 与周围残基建立键合(Fig 7A)，7-keto-LCA(IC=32.8 mM)和UDCA(IC=59.7 mM)为 FXR 拮抗剂(Fig 7B)，CDCA 可增加两种 FXR 下游标记-成纤维细胞生长因子19（FGF19）和小异二聚体伙伴（SHP）的表达(Fig 7C)，在肠细胞系中均被 TbMCA、UDCA 和7-keto-LCA所阻断(S10K、S10L)，UDCA和7-keto-LCA 均显著抑制了 FXR 转录激活活性(Fig 7D)，这些发现也在细胞共培养模型中得到了验证。
由于 LCA 也被报道为孕烷 X 受体（PXR）的激动剂，我们测量了 PXR 下游靶基因的 mRNA 水平，这些结果表明 LCA 确实激活了 PXR，而 7-keto-LCA 没有激活 PXR，这表明7-keto-LCA可能不像预想的那样激活 PXR。
胆汁酸处理的肠道类器官进行转录组，发现PCA图中CDCA组与其他三组差异大(Fig 7F)。UDCA 和 7-keto-LCA 都促进了干细胞标志物(Lgr5-Ascl2)的表达(Fig 7E)， 7keto-LCA 处理抵消在 Wnt 信号通路和增殖相关通路中基因的抑制现象(Fig 7G)，这些发现为 FXR 拮抗剂如何维持干细胞扩展提供了可能的机制见解。此外类器官中的qPCR检测， FXR 靶基因 mRNA 表达减少，而干细胞标记物 mRNA 表达增加(Fig 7H)，体内实验结果显示，7-keto-LCA 和P. goldsteinii 灌胃均消除了阿司匹林对肠道隐窝中β-catenin 活性的抑制(Fig 7I)，免疫共沉淀显示在 UDCA 和 7-keto-LCA 处理后，FXR-β-catenin 相互作用水平增加(见附图)，这些数据表明，胆汁酸调节了 FXR 与β-catenin 的物理结合，FXR 拮抗剂 7-keto-LCA 通过促进 Wnt 信号通路来维持肠道隐窝细胞干性。
图7.FXR拮抗剂7-keto-LCA通过激活Wnt/β-catenin信号通路维持肠道干细胞功能
Fig 7A 7-Keto-LCA（红色的碳原子）对接到人类FXR结合口袋中，表明7-Keto-LCA可能是FXR拮抗剂(PDB: 3 dct)。
Fig 7B TR-FRET FXR共激活剂招募试验，以评估在激动剂CDCA存在下7-酮- lca和UDCA是否为FXR拮抗剂（20 mM）。N = 4复制/治疗。LCA作为阴性对照。
Fig 7C不同胆汁酸和合成的FXR激动剂fexaramine D（FexD）和GW4064处理HT-29细胞。FXR靶基因mRNA水平为RT-qPCR定量。N = 5个/组。
Fig 7D生成含有fxr结合序列的pGL3荧光素酶报告基因载体（左）。处理后检测荧光素酶活性DMSO、CDCA、7-酮- lca和UDCA。N = 5个重复/处理。
Fig 7E二级类器官分别用CDCA （20 mM）、7-酮- lca （20 mM）或UDCA （20 mM）处理5天，并进行下一代测序。的热图显示了干细胞基因标记（Lgr5-Ascl2）的变化。
Fig 7F (E)中指示基因标记的PCA。
Fig 7G 7-keto-LCA组和DMSO组测序结果的基因集富集分析（GSEA），靶向增殖和凋亡途径。
Fig 7H FXR靶点Fgf15和Shp编码的mrna（左）和肠干细胞标志物Lgr5、Ascl2和Olfm4（右）的RT-qPCR结果类器官按(E)所示处理。n = 5个重复/处理。mRNA水平与b-肌动蛋白水平归一化。
Fig 7I小鼠肠隐窝中Catb和Olfm4 mrna的表达，如图4A和4H所示。白色箭头标记有核的隐窝细胞b-catenin表达式。N = 10个生物重复/组。每个点代表每只老鼠20个随机隐窝的平均值。
我们通过临床队列和阿司匹林处理的小鼠，鉴定出一种肠道微生物——金氏副拟杆菌（Parabacteroides goldsteinii），其生长受到阿司匹林的抑制。补充戈氏副拟杆菌或其胆汁酸代谢物 7-酮石胆酸（7-keto-LCA）的小鼠显示出减少的阿司匹林介导的肠道微环境损伤和肠道屏障损伤，而戈氏副拟杆菌 hdhA 突变体（无法生成 7-酮-LCA）则失去了这种效果。具体而言，7-酮-LCA 通过抑制肠道胆汁酸受体法尼醇 X 受体（FXR）的信号通路，促进肠道上皮的修复。7-酮-LCA 被确认为 FXR 拮抗剂，它促进 Wnt 信号通路，从而促进肠道干细胞的自更新。这些结果揭示了口服阿司匹林对肠道菌群和肠道胆汁酸代谢的影响，进而调节胃肠道稳态。
吴岳(通讯作者)
博士，教授、博士生导师、西安交大一附院院长助理兼科技部长。在Nat Med、Cell Metab、Cell Host Microbe、Circulation等期刊发表多篇论文。兼任中华医学会心血管病学分会青年委员，中国生物物理学会代谢生物学分会理事，陕西省医促会心血管专委会副主委，擅长冠心病及高脂血症的介入及综合治疗。主持国家级课题4项。获得中国介入心脏病学大会（CIT）- 青年研究奖（一等奖）及“陕西青年五四奖章”。
信息来源：http://www.dyyy./info/1051/95341.htm
Frank J. Gonzalez (通讯作者)
Dr. Frank的研究聚焦于运用多种小鼠生物检测模型（针对结肠、肝脏、乳腺及其他癌症），深入探究化学致癌作用的机制。其工作涵盖对涉及核受体的信号转导通路及其在癌症发生与发展中作用的研究，并广泛利用基因工程小鼠模型。团队采用基于液相色谱-质谱技术的代谢组学方法，以发现癌症早期生物标志物并探索癌症发生机制。此外，该课题组还致力于研究肥胖、胰岛素抵抗等代谢性疾病的病因与治疗，这些疾病会显著增加患癌风险。
信息来源：https://irp./pi/frank-gonzalez
袁祖贻(通讯作者)
西安交通大学医学院第一附属医院副院长、心血管病医院院长、主任医师、教授、博士生导师，日本京都大学博士后。兼任国际动脉粥样硬化学会中国分会副主席，中国病理生理学会动脉粥样硬化专业委员会常务委员，国家心血管病专家第一届委员会委员，中华医学会心血管病分会常务委员，陕西省医学会心血管病分会主任委员。
主要致力于免疫炎症机制与动脉粥样硬化发生、发展关系的研究，尤其是在巨噬细胞炎性与活性调控在动脉粥样硬化病程进展中地位的研究方面取得了多个原创研究成果。先后主持国家项目“杰出青年基金”1项、国家“935”项目1项、国家自然科学基金重大研究计划4项、国家自然科学基金面上项目8项、完成教育部“985”建设工程项目、陕西省政府重大科技创新“13115”项目以及各类人才基金项目多项，共获得支持项目基金3000余万元，发表学术论文200余篇，其中SCI论文120余篇。多篇论文发表在国际著名刊物Nature Medicine、ATVB、JACC、Cardiovasc Res、JMCC等上，单篇最高影响因子27.36。
信息来源：http://www.dyyy./zjjs/nkxt/xxgnk/yzy.htm
翻译：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后
排版：刘家汇，西北农林科技大学，本科生
终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导
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