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3.1. GNL3L 在 ESCC 标本中表现较高，预后较差
根据 TCGA 的 EC 数据集，EC 肿瘤组织中GNL3L 的表达高于正常食管组织（见图 1a）[22 ， 23]。Kaplan–Meier 分析显示，GNL3L 表达较低（n=138）的 EC 患者生存概率优于 GNL3L 表达较高的（n=46）（见图 1b）。此外，GNL3L 的表达和存活概率与肿瘤等级相关（见图 1b）[8， 17]。患者队列基于从 GEPIA 和 UALCAN 网站下载的 TCGA EC 数据集的基因信息获得。作者所在医院患者中 GNL3L 的表达在 ESCC 组织中由强上调为阴性（见图 1c），其中 15 例表达较高，16 例表达中等，13 例表达微弱，10 例无染色。接着，作者评估了 ESCC 患者的 GNL3L 表达与临床病理特征之间的关系。结果显示，高表达 GNL3L 与 ESCC 患者淋巴结转移显著相关（p = 0.011）和远处转移（p = 0.008）。与 HEEC 相比，ESCC 细胞系中 GNL3L 上调较 HEEC，尤其是 TE-1、KYSE-410 和 KYSE-30 细胞系（见图 1d，e）。GNL3L 稳定敲低模型已成功通过 TE-1 细胞系完成，并通过 qRT-PCR 和西墨迹测量，SH-GNL3L 在 TE-1 细胞中的效率约为 70%（见图 1f，g）。
GNL3L 在食管癌（EC）中的表达及GNL3L 敲低的细胞系模型。（a） GNL3L 表达在 EC 肿瘤组织（n=182）和正常食管组织（n=286）中均使用 GEPIA 数据库进行分析。（b） Kaplan–Meier 分析，分析 EC 患者与 GNL3L 低表达患者（n=138）与 GNL3L 高表达（n=46）患者间的生存率。除了 GNL3L 的表达外，存活率还与肿瘤等级相关。患者队列基于从 UALCAN 网站下载的 TCGA 食管癌数据集的基因信息获得。（c）通过免疫组化检测食管鳞状细胞癌（ESCC）标本中 GNL3L 蛋白的差异表达。（d） qRT-PCR 用于检测 ESCC 细胞系（TE-1、KYSE-410、KYSE-30 和 EC9706）及人类正常食管上皮细胞系（HEEC）中的 GNL3L 表达。（e） 通过西方墨迹法（WB）评估了 ESCC 细胞系和 HEEC 中 GNL3L 蛋白的表达。（f）通过 qRT-PCR 测定 Te-1 细胞中对 GNL3L 的 sh-GNL3L 效率。（g） TE-1 细胞中 GNL3L 的蛋白质表达。（NC：负对照）。（*p < 0.05， **p < 0.01）3.2. 下调 GNL3L 抑制了 ESCC 细胞的存活能力、迁移和入侵，并促进了细胞凋亡
根据 CCK8 测试，sh-GNL3L、sh-NC 和对照组的 OD 值分别为 48 小时后 0.18、0.45 和 0.49,72 小时后为 0.3、0.6 和 0.62（p < 0.01）（见图 2a）。EdU 实验还显示，GNL3L 的敲低显著减缓了 TE-1 细胞的增殖（见图 2b）。在敲低 GNL3L 后，TE-1 细胞的 G1 期细胞被阻断（见图 2c）。根据伤口愈合测定结果，当 GNL3L 表达下调时，TE-1 细胞的愈合伤口宽度小于 sh-NC 和对照组细胞（见图 2d）。此外，Transwell 检测显示，当 GNL3L 表达被下调时，TE-1 细胞的迁移和侵入能力被抑制（见图 2e）。当 GNL3L 表达下调时，ESCC 细胞凋亡率显著增加（见图 2f）。
GNL3L 的下调抑制了 TE-1 细胞系中的恶性表型，包括增殖、入侵、迁移和凋亡。（a） 细胞计数套件-8（CCK8）检测和（b） EDU 检测，用于分析 TE-1 细胞系中细胞增殖情况，配合 sh-GNL3L、sh-NC 和对照组。（c） 不同基团中 TE-1 细胞相的分布。（d）伤口愈合检测结果为带有 sh-GNL3L、sh-NC 和对照的 TE-1 细胞系。（e） 通过 Transwell 检测评估了 TE-1 细胞的入侵和迁移情况。（f） 不同组中利用流式细胞术研究 TE-1 细胞系的凋亡结果（**p < 0.01）。
通过 qRT-PCR 和西方印迹法验证了 sh-GNL3L 在 ECA-109 细胞中的转染效率（图3a，b）。CCK8 检测结果显示，sh-GNL3L、sh-NC 和对照组的 OD 值分别为 48 小时后为 0.16、0.34 和 0.37,72 小时后为 0.36、0.55 和 0.58（p < 0.01）（见图 3c）。EdU 检测结果还显示，GNL3L 的敲低显著抑制了 ECA-109 细胞的增殖（见图 3d）。此外，敲低 GNL3L 后，ECA-109 细胞的迁移和侵入能力被抑制（见图 3e）。此外，敲低 GNL3L 后 ECA-109 细胞的凋亡率也有所增加（见图 3f）。
GNL3L 的下调抑制了 ECA-109 细胞系中的恶性表型，包括增殖、入侵、迁移和凋亡。（a）通过 qRT-PCR 检测 ECA-109 细胞中，针对 GNL3L 的 sh-GNL3L 效率。（b）ECA-109 细胞中 GNL3L 的蛋白表达。（c） CCK8 测定和 （d） EDU 测定，用于分析 ECA-109 细胞系中的细胞增殖，使用 sh-GNL3L、sh-NC 和对照组。（e） 通过 Transwell 检测评估 ECA-109 细胞的迁移和侵入情况。（f） 不同组中 ECA-109 细胞系利用流式细胞术进行细胞凋亡的结果（**p < 0.01）。3.3. GNL3L 积极调控 MDM2 表达并与 MDM2 相互作用
GNL3L 敲低后，MDM2 mRNA 和蛋白水平下调（见图 4a），而 TE-1 细胞中 p53 和 p21 水平上调（见图 4b）。共产细胞实验显示 GNL3L 与 MDM2 相互作用（见图 4c）。此外，MDM2 过表达增加了 GNL3L mRNA 和蛋白质表达（见图 4d，e）。
GNL3L 正向调控 MDM2 表达并与 MDM2 相互作用。（a）GNL3L 敲低后，进行了 qRT-PCR 和西墨迹（WB）以确定 TE-1 细胞中的 MDM2 表达。（b）敲低 GNL3L 后，TE-1 细胞中 p53 和 p21 表达的差异。（c）来自 ESCC 细胞系的 GNL3L 和 MDM2 共产蛋白。输入代表 IP 中使用的总蛋白提取物。在 ESCC 细胞中，GNL3L 蛋白表达被归一化为 GAPDH。（IP，免疫沉淀;IgG，负对照）。（d） 不同组 TE-1 细胞中 MDM2 和 GNL3L 表达的 qRT-PCR 分析。（e） 不同组中 TE-1 的 MDM2 和 GNL3L 蛋白表达由 WB 测定。（f） 使用 CCK8 检测方法分析了不同组的 TE-1 细胞系细胞增殖情况。（g） 使用 EdU 检测法分析了增殖情况。（**p < 0.01， ##p < 0.01）3.4. GNL3L 与 MDM2 相互作用以确定 ESCC 细胞的恶性表型
MDM2 的过度表达导致细胞增殖、侵入和迁移增加，而与 OE-MDM2 和 sh-GNL3L 的共转染则逆转了这些表型（见图 4，g，图 5，b）。ESCC 细胞中 OE-MDM2 和 sh-GNL3L 的共转染阻断了 G1 期细胞的分布（见图 5c）。同样，MDM2 过表达抑制了凋亡，与 OE-MDM2 和 sh-GNL3L 的共转染则提高了凋亡细胞的比例（见图 5d）。当 MDM2 过度表达时，p53 和 p21 在 ESCC 中下调，而当细胞与 OE-MDM2 和 sh-GNL3L 共转染时，p53 和 p21 上调（见图 5e）。因此，MDM2 的过度表达增加了 ESCC 细胞的恶性表型，而伴随的 GNL3L 下调则逆转了 MDM2 过度表达的影响。
GNL3L 敲低逆转了 MDM2 过度表达诱导 ESCC 细胞恶性行为的增加。（a）伤口愈合测定结果是来自不同组的 TE-1 细胞。（b）使用 Transwell 检测评估了 TE-1 细胞的入侵和迁移情况。（c） TE-1 细胞相在不同基团中的分布。（d） 在不同组中，通过流式细胞术测量了 TE-1 细胞的凋亡。（e）不同组 TE-1 细胞中 P53 和 P21 的表达。（**p < 0.01， ##p < 0.01）
此外，MDM2 的降级降低了 GNL3L 蛋白表达（见图 6a）。MDM2 基因降显著减少了 TE-1 细胞的增殖、侵入和迁移，而 GNL3L 过表达则逆转了这些表型（见图 6，c）。与此同时，MDM2 的降低增加了 TE-1 细胞的凋亡，而 GNL3L 的过度表达则显著逆转了细胞凋亡的增加（见图 6d）。如图 6e 所示，GNL3L 过表达显著逆转了由 MDM2 敲低诱导的 TE-1 细胞中 p53 和 p21 的上调表达。所有这些数据都表明 GNL3L 在 MDM2 效应中的作用。
GNL3L 过表达逆转了 MDM2 敲低诱导 ESCC 细胞恶性行为的降低。（a） 不同组 TE-1 细胞中 MDM2 和 GNL3L 的蛋白表达通过西部印迹（WB）测定。（b）使用 EdU 检测法分析了不同组的细胞增殖情况。（c） 使用 Transwell 检测评估了 TE-1 细胞的迁移和入侵情况。（d） 在不同组中，通过流式细胞术测量了 TE-1 细胞的凋亡。（e）不同组 TE-1 细胞中 P53 和 P21 的表达。（**p < 0.01， ##p < 0.01）3.5. 下调 GNL3L 抑制异种移植模型中 ESCC 的生长
随后，体外结果在体内得到确认。裸小鼠接种了表达或不表达GNL3L 的 TE-1 细胞。5 周后，小鼠被牺牲，sh-GNL3L 组肿瘤体积最小（见图 7a）。肿瘤称重后，sh-GNL3L 组肿瘤重量和体积最轻（见图 7，d）。对三组移植肿瘤进行了 HE 和 TUNEL 检测，结果显示 sh-GNL3L 组的凋亡细胞比例最高（见图 7e）。在 sh-GNL3L 组中，GNL3L 和 MDM2 的 mRNA 和蛋白表达低于其他组（见图 7，g）。
在敲低GNL3L 后，裸鼠肿瘤形成实验。（a）三组肿瘤细胞被植入裸鼠右腋下。（b） 三组裸鼠体重的变化。（c） 三组裸鼠的肿瘤体积。（d） 三组裸鼠移植肿瘤的大小。（e） HE 和 TUNEL 对三组移植肿瘤的检测。（f）三组 qRT-PCR 移植肿瘤中 GNL3L 和 MDM2 的 mRNA 表达。（g）三组通过西方墨迹法移植肿瘤的 GNL3L 和 MDM2 蛋白表达。（**p < 0.01）。
总结
该研究显示，较高的 GNL3L 表达与 ESCC 恶性表型相关。沉默 GNL3L 可以降低 ESCC 的侵袭性。MDM2 过度表达会增加 ESCC 恶性表型。GNL3L 的敲低调调会下调 MDM2，上调 p53 和 p21。未来研究应探讨如何针对 GNL3L 以改善 ESCC 管理。
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