|
PTP4A1 上调，并与 ICC 中的侵袭性病理特征相关
为了研究 PTP4A1 在 ICC 中的功能，首次在 ICC 组织中使用 WB 检测到 PTP4A1 表达。结果显示，与邻近正常组织相比，PTP4A1 在肿瘤组织中表达过多（ 见图 1A）。为进一步验证 PTP4A1 在 ICC 中的表达，使用 IHC 分析了 20 对 ICC 组织及匹配正常组织中 PTP4A1 的表达水平。结果显示 PTP4A1 在 ICC 组织中表达较高（ 见图 1B 和 C）。随后进行了 RT-qPCR 检测，以评估 40 对 ICC 肿瘤组织及相邻正常组织中 PTP4A1 的 mRNA 水平。PTP4A1 mRNA 在 ICC 中经常上调（ 见图 1D）。此外，还探讨了 PTP4A1 表达与 ICC 患者临床病理特征之间的关系。与淋巴结转移阴性 ICC 患者相比，淋巴结转移阳性患者的 PTP4A1 mRNA 表达更高（ 见图 1E）。此外，血管侵袭的 ICC 患者中 PTP4A1 mRNA 也过度表达（ 见图 1F）。与 I/II TNM 期 ICC 患者相比，PTP4A1 在 III/IV TNM 期 ICC 患者中表达较高（ 见图 1G）。此外，PTP4A1 的表达与 ICC 分化有关。分化不良 ICC 组织中的 PTP4A1 mRNA 表达高于分化良好和中度分化 ICC 组织（ 见图 1H）。综合来看，这些结果表明 PTP4A1 表达过度，且与 ICC 中侵袭性病理特征相关。
PTP4A1 表达较高，且与 ICC 中的侵袭性病理特征相关。（A） 10 对 ICC 组织（T）及相邻正常组织（N）中 PTP4A1 表达水平。（B）ICC 肿瘤组织及邻近正常组织中 PTP4A1 的 IHC 染色代表性图像。（C） ICC 肿瘤组织及相邻正常组织的 PTP4A1 IHC 评分。（丁）ICC 组织中的 PTP4A1 mRNA 水平高于邻近正常组织。（E-H）PTP4A1 的 mRNA 表达较高与（E）淋巴结转移、（F）血管浸润、（G）III/IV 期 TNM 分化及（H）ICC 分化不良呈正相关。*P<0.05和**P<0.01。PTP4A1，蛋白酪氨酸磷酸酶4A1;肝内胆管癌，肝内胆管癌;肝内胆管癌;肝内胆管癌; immunohistochemical.
PTP4A1 促进 ICC 细胞的增殖、迁移和体内侵入
为研究 PTP4A1 在 ICC 中的潜在生物学功能，RBE 和 HCCC-9810 细胞被稳定转染 PTP4A1 KD 和 OE 轻病毒。使用 WB 和 RT-qPCR 分析了 ICC 细胞系 RBE 和 HCCC-9810 中 PTP4A1 的表达水平。如图 2A 和图 B 所示，转染 PTP4A1 KD 慢病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞中 PTP4A1 表达显著降低，而转染 PTP4A1-OE 慢病毒的 REB 和 HCCC-9810 细胞的表达显著增加，而转染 NC 或 EV 慢病毒的 ICC 细胞则显著增加。随后进行了 CCK-8、EdU 和菌落形成等检测，以评估 PTP4A1 在 ICC 细胞增殖中的作用。CCK-8 检测结果表明 PTP4A1 促进了 RBE 和 HCCC-9810 细胞的增殖（见图 2C 和 D）。EdU 检测结果显示，转染 PTP4A1-KD 慢病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞的存活率低于相应的 NC 细胞（见图 2E 和 F）。与上述发现一致，转染 PTP4A1-OE 慢病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞的存活率高于相应的 EV 转染细胞（见图 2E 和 F）。此外，菌落形成检测结果显示，PTP4A1 提高了 RBE 和 HCCC-9810 细胞的存活能力（见图 2G 和 H）。此外，还在裸鼠中进行了皮下肿瘤形成实验，将 RBE 和 HCCC-9810 细胞转染为 PTP4A1-KD 长病毒或 NC 慢病毒。所有小鼠都成功形成了肿瘤。 ICC 肿瘤组织图像显示，源自 RBE 和 HCCC-9810 细胞转染 PTP4A1-KD 慢病毒的肿瘤比 NC 组的肿瘤小（图 2I）。肿瘤生长曲线显示，转染 PTP4A1-KD 慢病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞中肿瘤生长速度低于 NC 组的肿瘤（见图 2J）。由 RBE 和 HCCC-9810 细胞转染 PTP4A1-KD 慢病毒的肿瘤组织体积显著小于 NC 细胞的体积（见图 2K 和 L）。IHC 结果显示，在转染 PTP4A1-KD 慢病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞衍生的肿瘤组织中，增殖标志物 Ki67 的表达有所下降（见图 2N）。综合来看，这些结果表明 PTP4A1 在体外和体内均能促进 ICC 增殖。
PTP4A1 在体外和体内促进肝内胆管癌细胞增殖。（A）通过西方印迹法和（B）逆转录定量 PCR 检测了稳定转染 PTP4A1-OE 或 PTP4A1-KD 慢病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞中的 PTP4A1 mRNA 及蛋白表达水平。（C 和 D）细胞计数套件-8、（E 和 F）EdU 和（G 和 H）细胞菌落形成测定法被用于评估稳定转染 PTP4A1-OE 或 PTP4A1-KD 轻病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞的增殖和存活能力。（I）稳定转染 PTP4A1-KD 长病毒和 NC 细胞的 RBE 和 HCCC-9810 细胞注射入裸小鼠，成功建立皮下异种移植肿瘤（每组 n=5）。（J） 与 NC 组相比，PTP4A1-KD 组肿瘤重量显著降低。（K 和 L）裸小鼠中 RBE（K）和 HCCC-9810（L）细胞的肿瘤生长曲线。（M） Ki67 在异种肿瘤组织中代表性的免疫组织化染色。*P<0.05 和 **P<0.01。PTP4A1，蛋白酪氨酸磷酸酶 4A1;OE，过度表达;KD，击倒;NC，负面对照;EV，空矢量。
为进一步探讨 PTP4A1 在 ICC 转移中的作用，进行了伤口愈合测定，结果显示 PTP4A1-OE 增加了 RBE 和 HCCC-9810 细胞的迁移。然而，PTP4A1-downregulatedRBE 和 HCCC-9810 细胞的迁移能力有所下降（ 见图 3A 和 B）。同样，迁移检测结果显示 PTP4A1 促进 RBE 和 HCCC-9810 细胞的迁移（ 图 3C 和 D）。侵入检测显示 PTP4A1 增加了 RBE 和 HCCC-9810 细胞的侵入（ 图 3E 和 F）。此外，PTP4A1-OE 促进上皮间充质转移（EMT），PTP4A1-KD 抑制 EMT 在 RBE 和 HCCC-9810 细胞中（ 见图 3G-N）。此外，结果显示 PTP4A1-OE 显著提升 MMP2 和 MMP9 的表达水平，这两类酶是肿瘤侵袭和转移的关键酶。相反，PTP4A1-KD 会导致 MMP2 和 MMP9 表达减少（ 见图 3G-N）。在由 RBE 和 HCCC-9810 细胞转染 PTP4A1-KDlentivirus 的肿瘤组织中，上皮细胞标志物 E-cadherin 的表达降低，间充质细胞标记 N-cadherin 的表达增加（ 见图 3M）。这些结果表明 PTP4A1 促进 ICC 中的迁移、入侵和 EMT。
PTP4A1 促进肝内 cholangiocarcinoma.（A 和 B）伤口愈合及（C 和 D）迁移测试，检测 PTP4A1 对 RBE 和 HCCC-9810 细胞迁移的影响。采用侵入检测（E 和 F）评估稳定转染 PTP4A1-overexpressingPTP4A1 降压朗病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞的入侵能力。（G）稳定转染 PTP4A1-OE 和 PTP4A1-KD 慢病毒的 RBE 和 HCCC-9810 细胞中的 EMT 标志物及 MMP2/MMP9 表达。（国-不）定量分析（H）FN1、（I）E-钙粘蛋白、（J）N-钙粘蛋白、（K）维美丁、（L）MMP9 和（N）MMP2 表达水平。（M）肿瘤组织中的 E-cadherin 和 N-cadherin 表达水平为 immunohistochemistry.**P<0.01。PTP4A1，蛋白酪氨酸磷酸酶4A1;EMT，上皮-间充质过渡;OE，过度表达;KD，击倒;NC，负面对照;EV，空矢量。
PTP4A1 与 PTEN 相互作用，参与 PI3K/AKT/GSK3α通路的激活
为进一步阐明 PTP4A1 促进 ICC 进展的机制，进行了 Co-IP-MS 筛查与 PTP4A1 相互作用的蛋白。维恩图显示，87 种蛋白质可能与 PTP4A1 相互作用（图 4A）。其中重点关注了 PTEN。为进一步验证 PTP4A1 与 PTEN 的相互作用，进行了 IF 染色。结果显示，PTP4A1 在 RBE 细胞中与 PTEN 共定位（见图 4B）。共 IP 分析证实 PTP4A1 与 PTP4A1-OE 瘦病毒转染的 RBE 细胞中的 PTEN 相互作用（见图 4C 和 D）。PTP4A1 属于 PTP 家族，可能参与其相互作用蛋白的去磷酸化。接着，评估了 PTP4A1 对 PTEN 磷酸化的影响。结果显示，PTP4A1-OE 降低了 PTEN 磷酸化，而 PTP4A1 的 KD 提高了 RBE 和 HCCC-9810 细胞中 PTEN 的磷酸化水平，表明 PTP4A1 抑制了 PTEN 的激活（见图 4E）。PTEN 是 PI3K/AKT/GSk3α信号通路的负调控因子。随后检测到 PTP4A1-OE 和 PTP4A1-KD RBE 及 HCCC-9810 细胞中 PI3K/AKT/GSk3α信号的激活（见图 4E）。这些结果表明，PTP4A1 通过与 PTEN 相互作用并调控 PTEN，促进 PI3K/AKT/GSk3α信号通路的激活。
PTP4A1 与 PTEN 相互作用，调控 PI3K/AKT/GSKα通路的激活。（A） 维恩图，显示基于“1-PTP4A1-标志和 2-PTP4A1 标志，而非 1-PTP4A1-IgG，而非 2-PTP4A1-IgG”筛选标准，通过 co-IP-MS 筛选的潜在PTP4A1-interacting蛋白。（b） PTP4A1 在 RBE 细胞中与 PTEN 共定位。（C 和 D）进行了共离子检测以确认 PTP4A1 与 PTEN 之间的关联。（E） PTP4A1 调控 RBE 和 HCCC-9810 细胞中 PTEN/PI3K/AKT/GSKα信号通路的激活。PTP4A1，蛋白酪氨酸磷酸酶 4A1;PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物;共免疫沉淀（co-IP）;OE，过度表达;KD，击倒;NC，负面对照;EV，空矢量;磷酸化。
为进一步验证 PTP4A1 在 PTEN 磷酸化中的抑制作用，首次构建并转染到 RBE 和 HCCC-9810 细胞中的磷酸拟 PTEN 突变质粒（PTEN S380A）。WB 结果显示 PTEN S380A 的 OE 效果显著（ 见图 5A）。随后，PTEN S380A 质粒在 RBE 和 HCCC-9810 细胞中过表达，且 PTP4A1-OE 稳定。WB 发现，磷合成的 PTEN S380 突变体显著降低了 PI3K 和 AKT 的磷酸化水平（ 见图 5B）。此外，PTEN S380 的模拟磷酸化减弱了 PTP4A1 驱动的细胞增殖（ 图 5C 和 D）、入侵（ 图 5E 和 F）及转移（ 图 5G 和 H）在 RBE 和 HCCC-9810 细胞中的促进作用。这些发现表明，PTP4A1 可能通过调节 PTEN/PI3K/AKT 信号通路来发挥致癌作用。
PTP4A1 对 PTEN 磷酸化的抑制作用。（A）PTEN S380A 在 RBE 和 HCCC-9810 细胞中表达过量。（B） 采用西方印迹法检测 PI3K 和 AKT 的表达和磷酸化，以及转染磷酸拟 PTEN 突变质粒（PTEN S380A）的 PTP4A-OE RBE 和 HCCC-9810 细胞。（C-H）磷拟 PTEN S380A 逆转了 PTP4A1 对 RBE 和 HCCC-9810 细胞（C 和 D）增殖、（E 和 F）侵入及（G 和 H）转移的促进效应。**P<0.01。PTP4A1，蛋白酪氨酸磷酸酶4A1;PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物;OE，过度表达;EV，空矢量。
PTP4A1 通过调控 PTEN/PI3K/AKT/GSK3α信号通路促进 ICC 的进展
PTP4A1 促进细胞增殖、迁移和入侵;与 PTEN 互动;并促进了 PI3K/AKT/GSk3α信号通路的激活。此外，PI3K/AKT/GSk3α通路参与肿瘤进展。因此，假设 PTP4A1 促进细胞增殖、侵入和转移依赖于 PTEN/PI3K/AKT/GSk3α通路的调控。为验证该假设，RBE 和 HCCC-9810 细胞稳定转染 PTP4A1-KD 慢病毒，并结合 PTEN 抑制剂 SF1670 或 GSK3α抑制剂 SB216763。WB 结果显示，PTP4A1 的 KD 增加了 RTEN 磷酸化，并降低了 RBE 和 HCCC-9810 细胞中 PI3K/AKT/GSk3α通路的激活（见图 6A）。此外，PTEN 抑制剂 SF1670 显著抑制 PTEN 磷酸化，并激活了 RBE 和 HCCC-9810 细胞中 PTP4A1 KD 的 PI3K/AKT/GSk3α通路（见图 6A）。作为 PI3K/AKT 的下游分子，GSK3α抑制剂 SB216763 不影响 PTEN、PI3K 或 AKT 的磷酸化（见图 6A）。EdU 检测显示，PTEN 抑制剂 SF1670 和 GSK3α抑制剂 SB216763 显著减弱 PTP4A1 KD 对 RBE 和 HCCC-9810 细胞增殖的抑制作用（见图 6B 和 C）。此外，迁移（图 6D 和 E）及入侵检测（图 6F 和 G）的结果显示，PTEN 抑制剂 SF1670 和 GSK3α抑制剂 SB216763 逆转了 PTP4A1 KD 对红红细胞和 HCCC-9810 细胞迁移和侵入的抑制作用。 为验证 PTEN 抑制剂 SF1670 和 GSK3α抑制剂 SB216763 对其他通路（ERK 和 TGF-β）的非靶向效应，在与 SF1670 或 SB216763 及 TGF-β联合处理的 RBE 和 HCCC-9810 细胞中评估了 ERK 和 TGF-β信号通路。结果表明 SF1670 和 SB216763 并未显著影响这些细胞中 ERK 磷酸化水平或 TGF-β信号通路的激活状态，表明这些抑制剂未表现出非靶向效应（见图 6H）。综合来看，这些结果表明 PTP4A1 通过调控 PTEN/PI3K/AKT/GSk3α通路促进 ICC 的进展。
PTP4A1 通过调控 PTEN/PI3K/AKT/GSk3α通路，促进肝内胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。（A） WB 用于检测 PTEN 抑制剂 SF1670 或 GSK3α抑制剂 SB216763 处理的 PTP4A-KD RBE 和 HCCC-9810 细胞中 PTEN、PI3K、AKT 和 GSk3α的表达和磷酸化。（B 和 C）采用 5-乙炔-2′-脱氧尿苷测定法评估 PTEN 抑制剂 SF1670 或 GSK3α抑制剂对 PTP4A-KD RBE 和 HCCC-9810 细胞增殖的影响 SB216763。（D-G）SF1670 和 SB216763 减弱了 PTP4A1 敲低对 RBE 和 HCCC-9810 细胞中（D 和 E）迁移及（F 和 G）侵入的抑制作用。（H） WB 用于评估与 SF1670 或 SB216763 和 TGF-β共处理的 RBE 和 HCCC-9810 细胞中的 ERK 和 TGF-β信号通路。**P<0.01。PTP4A1，蛋白酪氨酸磷酸酶4A1;PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物;WB，西部污点;KD，击倒;NC，负面对照;磷酸化。
总结
总之，本研究表明 PTP4A1 在 ICC 中表现过高且与侵袭性病理特征相关。作为致癌基因，PTP4A1 促进细胞增殖、迁移和侵入，依赖于 PTEN/PI3K/AKT/GSk3α通路的调控，表明 PTP4A1 可能成为 ICC 的有价值治疗靶点。
|
