结果：
3.1. RA 滑膜微环境的单细胞景观
最初，利用GSE192504 数据集选取两份滑膜组织样本进行单细胞分析（ 图 2A）。作者检查了线粒体基因和血细胞比值以进行质量控制，以确保单细胞转录组数据集分析的完整性和可靠性。最终，260 个来自正常组织的细胞和 1800 个符合条件的 CIA 组织细胞被纳入后续分析。鉴于数据集中细胞周期阶段的潜在异质性，作者使用细胞周期评分技术评估了这些阶段在样本中的一致分布。过滤数据采用 HARMONY 方法分析，重点关注高度变异的基因。接着，作者利用 t-SNE 将所有细胞分类为 18 个簇（ 见图 2B）。基于 SingleR 及相关文献，作者将细胞分为七种类型：巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞、T 细胞和 B 细胞（ 图 2C）。点阵图显示了与每个细胞群体相关的标记基因的表达水平（ 图 2D）。与健康对照组相比，巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和单核细胞显著增加，而类风直性关节炎滑膜内皮细胞相对减少（ 见图 2E）。中性粒细胞的丰度增长最为显著（ 见图 2F）。这些发现表明正常样本与类风湿性样本之间滑膜微环境存在异质性景观。 RA 滑膜微环境的单细胞景观。（A） 单单元分析流程图。（B） t-SNE 图，显示通过降维聚类分析从 GSE192504 数据集中识别出的 18 个簇（0-17）。（C） 根据 SingleR 和文献，将簇注释为 7 种细胞类型。（D） 标记基因表达水平的点图，按不同细胞类型注释。（E）RA 与健康对照组在细胞分布和表达上的差异。（F） 类风湿关节炎和健康对照组滑膜组织中每种细胞类型丰度比例的叠加图。 3.2. 类风湿滑膜微环境中细胞间通讯的动力学分析 剖析中性粒细胞与其他细胞群体在滑膜炎症微环境中的相互作用，尤其是与成纤维细胞的交流，将有助于进一步阐明类风湿关节炎中 NETs 形成的机制。对“CellChat”软件包的评估显示，中性粒细胞和成纤维细胞都向其他细胞发送大量信号，表明其高激活率与类风湿关节炎的发生有关（图 3A）。此外，作者深入探讨了细胞通信网络中的关键配体通路。结果显示，从中性粒细胞到成纤维细胞的主要通路是胶原蛋白、MIF 和 Fn1 信号通路（见图 3B–D）。作者还发现这些相互作用主要通过 Col1a1-Sdc4 相互作用发生（图 3E）。此外，调控免疫反应和炎症的 CXCL 信号通路在类风湿性关节炎微环境中起着重要作用。作者发现中性粒细胞作为信号发起者和影响者，主导了该通路（见图 3F）。有趣的是，CXCL2-CXCR2 对该通路贡献最大，表明它可能对促进中性粒细胞与类风湿性关节振风（RA）微环境中其他细胞之间的串扰至关重要，值得进一步研究。总体而言，这些发现强调了中性粒细胞通过多条信号通路及相关配体影响类风湿性关节炎微环境中的成纤维细胞。 类风湿关节炎滑膜微环境中细胞间通讯的动力学分析。（A） 圆图，绘制 RA 组七个主要细胞亚簇间相互作用权重，详细显示成纤维细胞和中性粒细胞。（B-D） 中性粒细胞与成纤维细胞相互作用的三大信号通路（胶原蛋白信号通路、MIF 信号通路和 Fn1 信号通路）的图形表示，包括弦图（左）和圆图（右），展示了细胞相互作用的过程。（E） 点图，突出好中性粒细胞与类风湿性关节炎微环境中其他细胞之间的配体-受体对，点的大小代表通路参与的 p 值，并以通讯概率为颜色。（F） CXCL 信号通路的图形表示，包括展示细胞相互作用过程的弦图和圆图、突出相互作用强度的探索性热图，以及探索基因表达水平的小提琴图。 考虑到 NETs 有效促进类风湿关节炎的滑膜病理微环境，作者接着鉴定了与 NETs 相关的关键基因和功能特征（图 4A）。作者合并并批次归一化了 GEO 下载的三个数据集——GSE55235、GSE55457 和 GSE206848，广泛全面地探索更大训练队列中的关键基因，为后续分析提供包括 25 份类风湿性关节炎患者滑膜活检和 27 条匹配健康个体滑膜活检（图 4B）).随后，从训练队列中识别出 1419 个 DEGs，其中 763 个上调，656 个下调，基于 P < 0.05 和|logFC|> 1.5（图 4C）。从上调-下调基因中挑选出前 50 个基因，形成热图（图 4D）。随后，作者对 DEGs 进行了 Go 和 KEGG 富集分析，以表征 RA 功能。通向分析显示，这些差异基因主要参与免疫反应的正向调控、细胞激活调控、白细胞激活、细胞对细胞因子刺激的反应以及细胞因子生成的正向调控等免疫相关生物过程（图 4E）。KEGG 富集分析确定了前 10 条显著富集通路，包括：细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、NF-kappa B 信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成及其他炎症相关通路（见图 4F）。此外，作者进行了 GSEA 富集分析，以探讨 RA 滑膜与正常样本在基因功能的差异。在富含 GO 的 GSEA 中，中性粒细胞迁移、趋化性和脱颗粒，以及对抗原刺激的急性炎症反应和炎症反应的正向调控，在类风湿性关节炎中显著被激活（见图 4G）。值得注意的是，在 KEGG 富集的 GSEA 中，趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用和 Toll 样受体信号通路在 RA 中显著富集（见图 4H）。这些结果强烈表明中性粒细胞迁移和炎症反应参与类风湿关节炎滑膜病理的进展。 类风湿关节炎的差异基因鉴定与生物学特征分析。（A） 批量 RNA 测序分析示意图。（B） 基于 UMAP 的分析显示 GSE55235、GSE55457 和 GSE206848 中样品表达在去批次效应前后分布。（C） 火山图，显示训练队列中 RA 与对照组间的差异表达基因（|logFC| > 1.5 和 P < 0.05），由三组数据集合并。（D） 热图，显示两个样本差异表达分析中前 50 个上调/下调基因。（E） 展示 RA 关键基因 GO 功能分析结果的条形图。（F） 显示 RA 关键基因 KEGG 分析结果的气泡图。基于基因表达水平的 GSEA 对 GO 富集 （G） 和 KEGG 富集 （H）的结果。 3.4. WGCNA 的构建及 RA 关键模块基因的鉴定 作者利用 WGCNA 构建了基因共表达网络，准确挖掘了与类风湿性关节炎相关的关键基因模块。基于模块独立性和平均连通性，作者将软阈值β参数设为 3，以确保构建无尺度的基因网络，其中对应的 R2 为 0.88，且平均连通性非常高（见图 5A、B）。接下来，作者构建了基因层级聚类树轮图，并识别出 25 个基因共表达模块（图 5C）。模之间的相关性如图 5D 所示。此外，作者通过相关分析识别了每个模块中基因与临床性状之间的关联。在模块-临床性状关系热图中，绿松石色（r = 0.78）、蓝色（r = 0.63）和绿色模块（r = -0.62）与 RA 的相关性最强（图 5E）。散点图显示 GS 与 MM 在三个模块中均有强烈相关性（图 5F –H）。随后，作者筛查了共 204 个中心模块基因，GS > 0.1 和 MM > 0.8 进行后续分析。 WGCNA 的构建及 RA 关键模块基因的鉴定。（A） 估计不同软阈值幂的尺度无关指标。（b） 不同软阈值功率的平均连通性估计。（C） 基因层级聚类树轮图，其中不同模块用不同颜色表示。（D） 用于模块间相关分析的热图。（E） 模块特征基因与 RA 组和正常对照组临床性状之间的关系，模块中的数字代表相关系数和 p 值。Cytoscape 可视化了模块内候选中心基因的进一步筛选（阈值为 GS > 0.1 和 MM > 0.8）。绘制散点图以显示绿松石模组 （F）、 蓝模组（G） 和绿模组 （H） 内 GS 和 MM 之间的关联。 3.5. 类风湿关节炎中 NETs 相关枢纽基因的鉴定 作者在 GSE150466 数据集上进行了差异基因鉴定，共获得 1895 个 NET 相关 DEGs（图 6A），其中包括 886 个上调（蓝色）和 1009 个下调（红色）基因，以探讨 NET 形成的关键机制。随后，作者将上述 DEG 与 RA 相关 DEG 及关键模块基因交叉，获得了 36 个特征枢纽基因（见图 6B）。热图显示了这些枢纽基因在训练集中表达的差异（图 6C）。相关环图显示所有差异表达的基因之间表现出强烈的调控关联（图 6D）。进行了全面的基因注释和功能富集分析，以阐明这 36 个关键基因的潜在功能。基于 GO 富集分析，12 个 BP 项、5 个 CC 项和 7 个 MF 项在核心基因中显示出统计学显著的富集（见图 6E）。显著的血压富集包括蛋白质磷酸化的正向调控、MAPK 级联的调控、趋化性、细胞激活的正向调控、炎症反应的调控以及免疫反应的负向调控。KEGG 富集分析显示，类风湿性关节炎中的 NET 相关基因主要参与 TNF 信号通路、IL-17 信号通路、Th17 细胞分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用、FoxO 信号通路和趋化因子信号通路。趋化因子信号通路及其他关键通路（图 6F）。作者还通过前述单细胞定位（图 6G）揭示了这 36 个特征基因在类风湿滑膜微环境中的分布。作者观察到这些基因在中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞中显著富集，其中表达最为丰富的是中性粒细胞。图 6H 显示了这些基因的染色体位置。此外，作者整合并应用了三种机器学习算法，以简化最关键的特征变量。基于 10 倍交叉验证结果，LASSO 识别出八个潜在候选基因（见图 6I，J）。SVM-RFE 算法识别出了 11 个最重要的 NET 相关 DEGs（见图 6K）。射频算法根据错误率和分类树数量确定前 23 个基因的重要性（见图 6L、M）。通过交叉三种算法的结果，最终得出四个交集基因（见图 6N），即 CRYBG1、RRM2、MMP1 和 SLC19A2，这些基因将在作者未来的研究中作为关键基因进行研究。 类风湿关节炎中 NETs 相关核心枢纽基因的鉴定。（A） GSE150466 数据集中火山图，显示 NETs 刺激与未刺激 FLS 基因差异（|logFC| > 1.5 和 P < 0.05）。（B） UpSet 交叉图，显示 RA-DEG、共表达关键模块基因和 NETs-DEG 之间交集基因的分布。（C） 显示 36 个交叉互换基因表达差异的热图，该组列中特征基因。（D） 36 个基因共表达的环状相关连通性图。（E） 圆图，显示 36 个特征基因的 GO 富集分析结果，包括 12 个 BP 词、5 个 CC 词和 7 个 MF 词。（F）Sankey 气泡图，显示 KEGG 最重要的十大浓缩结果。（G） t-SNE 图，显示 36 个被鉴定基因在单细胞层面不同细胞中的分布。（H） 36 个特征基因的圆图，这些基因定位于染色体上。（I） 基于 LASSO 回归和 10 重交叉验证，获得了八个候选枢纽基因。（J） 在 LASSO 模型中生成对数（λ）序列的系数轮郭，垂直虚线是最优的 log（λ） 值。（K） 通过 SVM-RFE 算法识别后建立 11 个潜在枢纽基因。（L） 随机森林树图，显示错误率与分类树数量的关系，其中红、绿、黑点分别代表 RA 样本、正态组样本和所有样本。（M） 条形图，显示根据重要性评分排名前 23 的基因。 （N） 维恩图，展示了上述三种算法识别出四个最终 NETs 相关核心基因的过程。 3.6. NETs 相关计式图的发展及免疫浸润的特性分析 在训练队列中，CRYBG1、RRM2 和 MMP1 在 RA 患者中表达较高，而 SLC19A2 在正常组中表达较高（见图 7A）。作者基于训练队列中的四个核心基因开发了类风湿关节炎疾病预测模型，以确定已识别核心基因的诊断和预测能力。在计尺图中，每个特征变量对应一个特定分数，每个样本内所有特征分数的总和代表 RA 的概率（图 7B）。ROC 曲线分析显示，候选基因在命名图模型中的 AUC 值均为> 0.9，表明该模型在区分类风湿关节炎患者与健康个体方面具有有效性，且该指标在单基因预测价值上更优（见图 7C）。校准曲线表明，构建的诺姆图诊断模型的预测概率非常接近理想曲线，表明模型预测准确率较高（见图 7D）。DCA 进一步说明，基于构造的命名图模型相比所有干预或不干预干预，在诊断 RA 方面带来更高的净效益（见图 7E）。同样，CIC 显示模型估算的高风险个体数与真阳性事件数趋于一致（见图 7F）。作者还探讨了 RA 训练队列中免疫细胞浸润的模式。 结果显示，类风湿关节炎组的记忆 B 细胞、浆细胞、T 细胞 CD8、T 细胞 CD4+记忆细胞和巨噬细胞 M1 的丰度显著增加，而 T 细胞 CD4 静息、单核细胞、活化肥大细胞和嗜酸性粒细胞的浸润显著减少（图 7G，H ）。相关分析显示，这四个核心基因与大多数免疫细胞高度相关（图 7I）。其中，CRYBG1 与记忆 B 细胞和浆细胞呈强正相关，MMP1 和 RRM2 与嗜酸性粒细胞呈强负相关，SLC19A2 与嗜酸性粒细胞呈强正相关。这些结果证实了此前发现的枢纽基因表达与类风湿关节炎免疫浸润模式之间不可分割的关系。 构建具有免疫浸润特征的 NET 相关传记图。（A） 对训练队列中对照组与 RA 组四个 NET 相关枢纽基因的表达水平比较。（B） 基于四个 NETs 相关枢纽基因的疾病预测评分建模，用于 RA 诊断。（C） 该模型的 ROC 曲线及模型中四个 NET 相关枢纽基因的诊断表现。（D） 由计式图模型预测的校准曲线。（E） DCA 曲线由命名图模型预测。（F） 计式图模型的临床影响曲线。（G） 使用 CIBERSORT 算法分析的训练队列中各种免疫细胞浸润的比例。（H） 训练队列中 RA 组与对照组不同免疫细胞浸润水平的比较。（I） 相关热图，展示 NETs 相关枢纽基因与各种浸润免疫细胞及免疫细胞之间的相关性。数据以均值±标准差表示。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001. 3.7. 外部验证 NETs 相关枢纽基因及目标基因网络构建 考虑到合并数据集可能带来的偏倚，作者选择了外部数据集 GSE77298 来验证四个枢纽基因的表达（图 8A）。在对 16 个 RA 样本和 7 个对照样本的比较中，作者识别出 1414 个上调的 DEGs 和 2100 个下调的 DEG（见图 8B）。热图进一步展示了两组在中心基因表达上的差异（图 8C）。具体而言，CRYBG1、RRM2 和 MMP1 在 RA 组的水平高于正常组，而 SLC19A2 表现显著较低（见图 8D），与训练组观察结果一致。外部数据集中四个枢纽基因的诊断值通过 ROC 曲线分析评估，结果显示四个基因的 AUC 值均超过 0.80，显示在识别 RA 方面表现良好（见图 8E）。此外，为确认枢纽基因及其相关的上下游相互作用因子，作者构建了 TF-基因相互作用网络、基因-miRNA 相互作用网络和 TF-miRNA 共调控网络（图 8F –H）。作者发现 RRM2 在枢纽基因相互作用中占据核心位置，IRF1 是关键调控因子，has-mir-98-5p 在枢纽基因网络中发挥重要的协调作用。 对 NETs 相关枢纽基因的外部验证及目标基因网络的构建。（A） 外部验证数据集分析的示意图 GSE77298。（B） 火山图，显示外部验证数据集 GSE77298 中差异表达基因（|logFC| > 1.5 和 P < 0.05），其中标记了 4 个枢纽基因。（C） 显示 GSE77298 数据集中四个枢纽基因表达差异的热图。（D） 比较 GSE77298 中 4 个 NETs 相关枢纽基因的表达水平，对照组与 RA 组的比较。（E）ROC 曲线，突出 GSE77298 中 4 个 NETs 相关枢纽基因的诊断表现。（F）TF-基因相互作用网络的构建。（G） 构建基因-miRNA 调控网络。（H） TF-基因-miRNA 共调控网络的构建。数据以均值±标准差表示。*P < 0.05， ***P < 0.001 通过建立 AA 大鼠模型，验证了综合生物信息学分析的结果。H&E 染色显示，模型组滑膜组织表现出增厚、紊乱和显著的炎症细胞浸润，相较对照组，证实了后续分析的成功建模（见图 9A）。作者利用 IHC 分析分析了小鼠滑膜中这四个关键基因的表达。IHC 结果显示对照组滑膜组织中 CRYBG1、RRM2 和 MMP1 蛋白染色量较少（棕色），模型大鼠在滑膜中的分布和表达显著高于对照组（P < 0.0001）。相比之下，SLC19A2 表达则呈相反方向（见图 9B–E）。这些结果与数据库中获得的结果一致。 验证小鼠模型中关键基因表达。（A） 小鼠模型滑膜组织的 H&E 染色图像。通过 IHC（标准条=50 微米）检测到小鼠膝关节滑膜组织中 CRYBG1（B）、RRM2（C）、MMP1（D） 和 SLC19A2（E） 蛋白的表达。数据以均值±标准差表示。P < 0.001， ****P < 0.0001. 3.9. 临床队列中 NET 形成和枢纽基因表达的验证 作者筛查了 30 名类风湿性关节炎患者和 20 名符合条件的健康对照组，，以阐明 NET 相关枢纽基因与类风湿关节炎临床特征之间的关系。IF 影像显示，RA、MPO 和 NE 中 NETs 的关键标志主要定位于中性粒细胞核，阳性染色明显低于对照组（图 10A、B）。随后，进行了 RT-qPCR 检测关键基因的表达水平。结果显示 CRYBG1、RRM2、MMP1 和 SLC19A2 的 mRNA 表达水平有显著差异，趋势总体与生物信息学分析一致（图 10C–F）。此外，作者的单向逻辑回归分析确定了这四个枢纽基因在类风湿关节炎中的独立预测作用（见图 11A）。随后，作者构建了一个临床指标模型，以衡量已特征变量对类风湿关节炎预测的贡献（见图 11B）。ROC 曲线显示，计量图和特征变量的 AUC 均大于 0.7，显示预测能力良好（见图 11C）。校准曲线、DCA 和 CIC 曲线进一步支持了该模型的准确性和临床意义（见图 11D–F）。相关分析显示 CRYBG1 与 IgG 呈显著正相关;RRM2 与 ESR、ASO、射频和 C4 呈显著正相关;MMP1 与 NLR 和 ESR 呈显著正相关;SLC19A2 与抗 CCP 和 C4 呈显著负相关（图 11G–P）。整体这些结果表明，NET 相关的枢纽基因与 RA 的临床特征密切相关。 临床队列中对 NETs 的形成和中心基因表达的验证。（A，B） 免疫荧光显微镜检查显示类风湿关节炎中存在 NETs，定义为 MPO（绿色）和 NE（红色）（标准条=50 微米）。RT-qPCR 被用于检测中性粒细胞中枢基因 CRYBG1（C）、RRM2（D）、MMP1（E） 和 SLC19A2（F） 的表达水平。P < 0.001， ****P < 0.0001. 与 NETs 相关的枢纽基因在临床上具有相关性。（A）RA 预测中枢纽基因的逻辑回归分析森林图。（B） 临床类风湿关节炎预测指标模型基于 4 个与 NETs 相关的枢纽基因。（C） 模型的 ROC 曲线及模型内特征变量。校准曲线 （D）、DCA（E） 和 CIC（F） 均由该模型预测。（G-P）CRYBG1、RRM2、MMP1 及 SLC19A2 与实验室标志物之间的相关性分析。*P < 0.05， **P < 0.01。
总结
总之，作者的研究强调了中性粒细胞衍生的 NETs 在类风湿滑膜微环境视角中的独特作用。通过全面的生物信息学分析，作者识别出与 NETs 相关的关键枢纽基因，进而开发了准确的类风湿关节炎预测诊断模型，并揭示了密切相关的免疫浸润景观。这些发现为驱动 RA 的炎症和免疫机制提供了新的见解，并为开发有前景的靶向 RA 诊断工具提出了新方向 。
