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结果：
TRIM19 在具有获得性顺铂耐药和顺铂耐药细胞的子宫内膜癌组织中下调
TRIM19 在顺铂耐药子宫内膜癌中的功能尚不清楚。本研究收集了 11 份顺铂敏感（CIS-S）子宫内膜癌组织和 14 份顺铂耐药（CIS-R）子宫内膜癌组织，然后采用 RT-qPCR 检测 TRIM19 的 mRNA 水平。与 CIS-S 子宫内膜癌组织相比，CIS-R 子宫内膜癌组织（CIS-R）中的 TRIM19 mRNA 水平显著下调（图。1 为了进一步研究 TRIM19 在顺铂耐药子宫内膜癌中的作用，建立了顺铂耐药细胞系（Ishikawa/DDP），并证明与用相同剂量顺铂治疗的亲本石川相比对顺铂耐药（图 1B;图 S1）。顺铂敏感卵巢癌细胞的 IC50 值约为 30μM ，但顺铂耐药细胞的 IC50 值远大于 40μM （图 1B）。然后，检测石川/DDP 细胞中的 TRIM19 mRNA 水平，发现石川/DDP 中 TRIM19 的 mRNA 水平显著低于亲本细胞（图 1C）。同样，与亲本石川细胞相比，石川/DDP 细胞中的 TRIM19 蛋白水平也降低（图 1D，E）。这些结果表明，TRIM19 可能调节子宫内膜癌对顺铂的耐药性。
TRIM19 在具有获得性顺铂耐药和顺铂耐药细胞的子宫内膜癌肿瘤组织中下调。A 通过 qPCR 检测顺铂敏感（CIS-S，n = 11）和顺铂耐药（CIS-R，n = 14）患者子宫内膜癌标本中 TRIM19 的 mRNA 水平。GAPDH 用作内部控制。 将 B Ishikawa 和顺铂耐药的 Ishikawa/DDP 细胞与指定浓度的顺铂一起孵育过夜，然后通过 CCK-8 测定细胞活力。C、D 分别采用 qPCR 和蛋白质印迹法测定石川和顺铂耐药石川/DDP 细胞中 TRIM19 的 mRNA（C）和蛋白（D）水平。N = 5。E 分析了 TRIM19 的光密度。GAPDH 用作加载控制。**p < 0.01， p < 0.001， p < 0.0001
TRIM19 影响石川和石川/DDP 细胞的细胞活力
随后，为探讨 TRIM19 对子宫内膜癌细胞敏感性增强的影响，在石川和石川/DDP 细胞中过表达 TRIM19。使用蛋白质印迹分析发现，TRIM19 在石川和石川/DDP 细胞中成功表达（图。阿拉伯数字因此，使用连续浓度的顺铂处理石川细胞，发现在相同浓度的顺铂处理下，TRIM19 过表达的石川（IC50 值约为 18μM ）的细胞活力低于石川（IC50 值约为 30μM ）（图 2 此外，还观察到类似的结果，在相同浓度的顺铂处理下，TRIM19 过表达的 Ishikawa/DDP 细胞（IC50 值约为 38μM ）的细胞活力低于 Ishikawa/DDP 细胞（IC50 值远大于 40μM ）（图 2C ）。
TRIM19 影响 Ishikawa 和 Ishikawa/DDP 细胞的化学敏感性。将空载体（EV）或 Myc-TRIM19 质粒转染到 Ishikawa 和 Ishikawa/DDP 细胞中 48h，然后用抗 Myc 标签抗体裂解细胞进行蛋白质印迹分析。GAPDH 用作加载控制。将转染 EV 或 Myc-TRIM19 质粒的 B、C 石川（B）和石川/DDP（C）细胞与指定浓度的顺铂一起孵育过夜，然后制备细胞进行 CCK-8 测定。*p < 0.05， **p < 0.01， p < 0.001， p < 0.0001
TRIM19 的过表达下调子宫内膜癌细胞中的 TBX2
作者之前的实验发现 TBX2 可能与 TRIM19 结合。为了说明 TBX2 和 TRIM19 之间的相关性，首先在石川和石川/DDP 细胞中检测 TRIM19 和 TBX2 的表达水平。结果表明，与石川细胞相比，石川/DDP 细胞的 TRIM19 蛋白水平降低，而 TBX2 蛋白水平显著升高（图 19）。3、A、B）。这一发现表明 TBX2 可能与 TRIM19 呈负相关。为了进一步确认 TRIM19 是否可以影响和调节 TBX2，作者在细胞中过表达 TRIM19，发现 TRIM19 过表达可以下调石川和石川/DDP 细胞中的 TBX2（图。3、C、D）。相比之下，敲低 TRIM19 上调石川细胞中的 TBX2（图 S2）。
TRIM19 的过表达下调子宫内膜癌细胞中的 TBX2。 甲、乙 Western blot 法测定石川和石川/DDP 细胞中 TRIM19 和 TBX2 的蛋白水平（A），分析 TRIM19 和 TBX2 的光学密度（B）。GAPDH 用作加载控制。N = 5。用 EV 或 Myc-TRIM19 质粒转染 C、D 石川和石川/DDP 细胞 48 h，然后裂解细胞进行蛋白质印迹检测 TBX2 蛋白表达（C），并分析 TBX2 的光密度（D）。GAPDH 用作加载控制。N = 5。**p < 0.01， p < 0.001， p < 0.0001
TRIM19 的过表达下调了 Ishikawa/DDP 细胞中 TBX2 下游信号的表达
随后，在 TRIM19 过表达的 Ishikawa/DDP 细胞中也检测到 TBX2 下游 NRF2 的表达，发现其水平显着降低（图。4、A、B）。这一发现表明 TRIM19 过表达可以显着抑制 NRF2 水平。同样，在 TRIM19 过表达的石川/DDP 细胞中，NRF2 mRNA 水平也显著降低（图 4C）。为观察 NRF2 的靶基因是否也因 TRIM19 过表达而下调，采用 RT-qPCR 法测定 TRIM19 过表达的石川/DDP 细胞中 HMOX1 和 NQO1 的 mRNA 水平。结果表明，在 TRIM19 过表达的石川/DDP 细胞中，HMOX1 和 NQO1 的 mRNA 水平显著低于石川/DDP 细胞[图 4D，E]。此外，在 TRIM19 过表达的石川/DDP 细胞中，HMOX1 和 NQO1 的蛋白水平也显著降低（图 4A，B）。相反，HMOX1 和 NQO1 的过表达不会引起 TRIM19 表达的变化（图 S3）。总的来说，TRIM19 可以下调 TBX2/NRF2 信号传导。
TRIM19 的过表达下调了 Ishikawa/DDP 细胞中 TBX2 下游信号的表达。 用 EV 或 Myc-TRIM19 质粒转染 A、B 石川/DDP 细胞 48 h，然后裂解细胞进行蛋白质印迹，测定 NRF2、HMOX1 和 NQO1 的蛋白表达（A），并分析 NRF2、HMOX1 和 NQO1 的光密度（B）。GAPDH 用作加载控制。N = 5。C-E 上述细胞也被制备用于 qPCR 分析，以确定 NRF2 （C）、HMOX1 （D）和 NQO1 （E）的 mRNA 水平。GAPDH 用作内部控制。N = 5。p < 0.001，p < 0.0001
TRIM19 与 TBX2 结合并降低 TBX2 蛋白在子宫内膜癌细胞中的稳定性
先前的数据表明，TRIM19 调节 TBX2 的功能。因此，人们想知道 TRIM19 是否可以与 TBX2 蛋白相互作用。因此，通过免疫共沉淀实验证实了 TRIM19 与 TBX2 的相互作用。蛋白质印迹结果显示，TBX2 可以拉低 TRIM19 蛋白（图。5、A），TRIM19 也可以拉低 TBX2 蛋白（图 5B）。这些发现表明 TRIM19 可以与 TBX2 相互作用。TRIM19 作为 E3 连接酶，可以调节靶蛋白的稳定性。因此，认为 TRIM19 可能调节 TBX2 的蛋白质稳定性。随后的 CHX 追逐实验表明，在不同时间暴露时用 CHX 处理时，在 TRIM19 存在的情况下，石川/DDP 细胞中的 TBX2 蛋白水平显着降低[图 5C，D]。然而，在没有 TRIM19 的情况下，石川/DDP 细胞中的 TBX2 蛋白水平保持不变（图 5C，D）。结果最终证明，TRIM19 在顺铂耐药子宫内膜癌细胞中通过稳定性调节调节 TBX2 蛋白的表达水平。这一发现为推进顺铂耐药子宫内膜癌的临床治疗奠定了重要的理论参考。
TRIM19 与 TBX2 结合并降低 TBX2 蛋白在子宫内膜癌细胞中的稳定性。 用抗 TBX2 抗体裂解 Ishikawa/DDP 细胞进行免疫共沉淀（Co-IP），然后用指定抗体进行蛋白质印迹分析免疫沉淀复合物。用抗 TRIM19 抗体裂解 B 石川细胞进行 Co-IP，然后用指示抗体 Western blot 分析免疫沉淀复合物。将转染有或没有 Myc-TRIM19 质粒的 C，D 石川/DDP 细胞与 50 μg/ml 环己酰亚胺（CHX）一起孵育指定时间，然后裂解收获的细胞进行蛋白质印迹，以确定 TBX2（C）的蛋白表达。GAPDH 用作加载控制。还测量了光学密度 （D）。N = 5。p < 0.0001。
总结
观察到 TRIM19 在顺铂耐药子宫内膜癌组织和细胞系中的表达显着降低。相反，观察到 TRIM19 的过表达可增强子宫内膜癌的顺铂敏感性。机理探索表明，TRIM19 可以下调 TBX2 和 NRF2 信号传导。此外，TRIM19 可以与 TBX2 相互作用，导致其不稳定和降解。
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