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钙化性主动脉瓣疾病（Calcific Aortic Valve Disease, CAVD）是侵入性的瓣膜置换手术，发病率和死亡率高，然而，目前尚无获批的治疗药物，需要寻找导致该疾病发展的关键早期驱动因素。
CAVD进展分为多阶段，主动脉瓣叶上可能同时存在非疾病期、纤维化期和钙化期。组织解剖学上，疾病在不同解剖层上的进展存在异质性，主动脉瓣膜由三层构成：面向主动脉侧的富含胶原的纤维层、中间富含糖胺聚糖的海绵层，以及面向心室侧富含弹性蛋白的心室层。
考虑到疾病进展和组织学的异质性，传统研究方法受限，因而研究人员采用空间分层多组学方法，检测瓣膜解剖分层的蛋白质组信息和转录组信息，从而识别疾病进展的关键分子调控网络、细胞亚型和潜在的靶点。
本期分享的文献为：
Spatiotemporal Multi-Omics Mapping Generates a Molecular Atlas of the Aortic Valve and Reveals Networks Driving Disease
杂志：Circulation
IF：38.6
作者单位：哈佛医学院布莱根妇女医院
原文链接：
DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.117.032291
CAVD疾病进展多组学
方法：结合近红外分子成像、转录组学和蛋白质组学。对钙化人主动脉瓣叶染色，根据钙化程度将瓣膜分为非疾病期（ND），纤维化期（F）和钙化期（C）三个阶段的组织样本（1A-B）。
结果：PCA分析发现钙化期在基因和蛋白质谱表达上与非疾病期明显不同（1C）。差异表达分析鉴定疾病各阶段的差异蛋白（1D-G）。
Fig 1. CVAD多组学研究设计
瓣膜分层蛋白质组
方法：激光捕获显微切割技术分离主动脉瓣的纤维层、海绵层和心室层，使用TMT标记蛋白质组学进行定量分析。
结果：PCA分析和差异分析显示不同解剖层的瓣膜表现出不同特征的蛋白图谱（A-E）。
Fig 2. 主动脉瓣组织分层蛋白质组学
独立验证队列
方法：根据疾病分期和瓣膜解剖学分期的差异富集蛋白进行富集分析；
结果：纤维化期富集了与肌成纤维细胞激活、整合素信号传导和氧化应激相关的通路。钙化期富集了免疫系统、脂质代谢、MAPK 信号传导等。纤维层富集了整合素细胞表面相互作用、PI3K/Akt 信号传导通路和骨矿化调节通路。海绵层富集了血液凝固和氧化相关通路，提示该层也积极参与疾病进程。心室层富集了平滑肌收缩和心肌病变相关通路。
Fig 3. CAVD通路富集分析
钙化潜能评估
方法：
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钙化潜能评估：分离纤维层和心室层来源的瓣膜间质细胞（VICs）。钙化沉积染色评估 VICs 在成骨培养基和促钙化培养基下的钙化程度；
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蛋白组学：比较纤维层和心室层来源的VICs的蛋白质差异及体内组织层和体外VICs的蛋白质组差异；
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体外钙化模型：分析纤维层 VICs 在不同培养基条件下刺激7天后的蛋白质谱。
结果：纤维层来源的 VICs 在两种培养条件下均显示出更高的钙化倾向，证实了瓣膜钙化主要由纤维层驱动。VIC 蛋白质组与体内钙化期组织蛋白质组存在显著重叠，说明体外钙化模型构建成功。
Fig 4. 从纤维膜和心室肌细胞中分离瓣膜间质细胞建立钙化性主动脉瓣膜病模型
组织验证
方法：免疫荧光染色验证候选蛋白在组织层面特异性定位。
结果：组织水平验证疾病各阶段的分子表达，并将GFAP+Vimentin+细胞被确定为海绵层VICs 的特异性标记。
Fig 5. CAVD蛋白质免疫荧光定位
CAVD 分子网络
方法：分析蛋白相互作用网络，计算 CAVD 钙化期模块与其他 38 种人类疾病模块在 PPI 网络中的平均最短距离
结果：发现 Fibronectin-1 (FN1) 在钙化期和纤维层中均是核心蛋白，CAVD 钙化期网络与多种炎症和纤维化疾病，如血管炎、系统性红斑狼疮、肺纤维化、高胆固醇血症，显示出显著的网络接近性。
Fig 6. CAVD 分子网络和疾病关联分析
研究亮点
1）研究将瓣膜样本分割为非疾病期、纤维化期和钙化期三个阶段，揭示了各阶段独特的转录和蛋白质表达特征。
2）利用激光捕获显微切割技术，对瓣膜的三个解剖层进行分层蛋白质组研究，发现海绵层瓣膜间质细胞的特异性标记GFAP，并通过通路富集分析鉴定CAVD与多种炎症性和纤维化疾病存在网络相关性。
3）比较体外钙化模型，证实纤维层具有更高的钙化潜能，重现体内钙化组件，为后续的药物筛选提供了可靠的体外模型。
蛋白质组应用文献回顾
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