微精选

胆固醇和脂肪酸通过竞争性氧化调节ACAT2的半胱氨酸泛素化

Cholesterol and fatty acids regulate cysteine ubiquitylation of ACAT2 through competitive oxidation

期刊：Nature

汇报人：赵添

1. 研究背景

胆固醇、脂肪酸是生命活动中所必需的脂类分子，但是这些极性分子如果在体内过量积累会导致病变，比如动脉硬化、II型糖尿病。已知脂类分子过度累积常会导致活性氧ROS的累积，导致氧化损伤。然而人们对细胞如何感受这些脂质分子产生的氧胁迫并应对知之甚少。胆固醇酰化转移酶ACAT位于内质网膜，催化胆固醇与脂肪酸间酯键的形成，生成胆固醇酯。该酶是胆固醇及其酯类代谢平衡的关键酶之一，在胆固醇的吸收、转运、细胞膜功能作用等生理过程发挥极其重要作用。病理上，它在巨噬细胞中大量地合成胆固醇酯，形成泡沫细胞（动脉硬化等早期病变）；影响神经细胞膜内的胆固醇，直接调节产生A-beta，从而与Alzheimer disease相关；在肝肠细胞中的活性变化，影响胆固醇酯的合成与血液转运，而与高胆固醇相关。人的ACAT家族基因有两个成员ACAT1、ACAT2，前者在各种组织细胞中广泛表达，而ACAT2基因主要在肝肠细胞表达。该研究揭示了特殊的泛素化修饰：半胱氨酸泛素化修饰，并揭示其重要生物学意义。

2. 研究结果

胆固醇酰化转移酶ACAT位于内质网膜，催化胆固醇与脂肪酸间酯键的形成，生成胆固醇酯。该酶是胆固醇及其酯类代谢平衡的关键酶之一，在胆固醇的吸收、转运、细胞膜功能作用等生理过程发挥极其重要作用。病理上，它在巨噬细胞中大量地合成胆固醇酯，形成泡沫细胞（动脉硬化等早期病变）；影响神经细胞膜内的胆固醇，直接调节产生A-beta，从而与Alzheimer disease相关；在肝肠细胞中的活性变化，影响胆固醇酯的合成与血液转运，而与高胆固醇相关。人的ACAT家族基因有两个成员ACAT1、ACAT2，前者在各种组织细胞中广泛表达，而ACAT2基因主要在肝肠细胞表达。

研究人员首先发现甾醇（胆固醇sterol）和饱和脂肪酸（如PA, 16:0）能够稳定ACAT2，植物甾体（sitosterol等）却没有此效果 （图 1）。

图1. 左图，甾醇处理能稳定ACAT2，植物甾醇则无此效果。右图，饱和脂肪酸也能稳定ACAT2蛋白

随后实验表明胆固醇、饱和脂肪酸稳定ACAT2蛋白和抑制其泛素化修饰有关 （图 2），接下来就是鉴定具体的泛素化位点。一般泛素化发生在蛋白质赖氨酸侧链，但是研究者将ACAT2上所有赖氨酸突变后，发现其泛素化水平仍然被脂质诱导，表明存在其它的泛素化位点 （图 2）。

图2. 左图，脂质处理会抑制ACAT2蛋白泛素化。右图，ACAT2泛素化不在其赖氨酸残基上

作者通过domain truncation寻找泛素化区域，最后发现泛素化发生在第252-279区域，而泛素化还可能发生在Ser、Thr、Cys残基上，因此通过点突变实验发现泛素化发生在Cys277上 （图 3）。

图 3. ACAT2泛素化发生在C277残基上

一般来讲，蛋白质赖氨酸发生的泛素化修饰比较稳定，而半胱氨酸上泛素化修饰不稳定，在一定还原剂作用下会去修饰。那么ACAT2的泛素化发生在半胱氨酸上是否暗示其受氧化还原调控？研究人员利用DCP-biotin探针去检测ACAT2的C277，是否能在在脂质处理诱导的ROS条件下产生sulfenic acid。最后结果证实了C277的确在ROS条件下会被氧化 （图 4）。

图4. 利用DCP-biotin探针检测C277巯基的氧化态

接下来研究人员鉴定催化ACAT2的Cys277泛素化的E3 ligase。利用ACAT2抗体亲合层析，结合蛋白质质谱技术，研究人员鉴定了一个ACAT2结合蛋白E3 ligase，gp78，通过遗传实验证明其具有泛素化活性 （图 5）。随后的转基因小鼠模型中，ACAT-／-小鼠不能将累计的活性脂质转化为较为惰性的酯类，加速了高脂食物诱导的insulin resistance，稳定了ACAT2蛋白则可以减轻insulin resistance。

图5. GP78 KO细胞中，即使在没有脂质处理的条件下ACAT2含量也显著高于对照

3. 总结与展望

（1）揭示了脂类如何通过影响Cys氧化，抑制其泛素化而稳定ACAT2，从而调节体内脂类活性状态的水平；

（2）揭示了Cys泛素化及其生物学意义；

（3）鉴定了Cys泛素化酶 E3 ligase。

（4）ACAT2作为细胞内膜上，感受胞内感应ROS sensor，调控胞内脂类活性状态。对研究、治疗ROS诱发的一些代谢疾病，比如II型糖尿病都有很重要的参考价值。

基于机器学习的模式识别可识别油掺假和食用油混合物

Pattern recognition based on machine learning identifies oil adulteration and edible oil mixtures

期刊：Nature Communication

IF=16.6

汇报人：黄钦乐

1. 研究背景

先前的研究表明，每种食用油类型都有其独特的脂肪酸特征;然而，目前还没有描述任何方法允许仅根据这一特性来识别油类型。此外，特定油类型的脂肪酸谱可以通过 2 种或多种油类型的混合物来模拟。这导致了欺诈性油掺假和故意错误标记食用油，威胁食品安全和危害公众健康。在这里，作者提出了一种机器学习方法，以揭示区分十种不同植物油类型的脂肪酸模式及其内部变异性。同时还描述了一种监督端到端学习方法，该方法可以推广到任何给定混合物的油成分。在大量模拟油混合物上进行训练后，独立测试数据集验证表明，对于十种油类型的任何 3 元混合物，该模型的 50个百分位绝对误差在 1.4-1.8% 之间，90个百分位误差为 4-5.4%。深度学习模型也可以通过在线训练进一步完善。由于产油厂具有不同的地理来源，因此脂肪酸谱略有不同，因此在线培训方法也提供了一种获取目前无法获得的有用知识的方法。作者的方法能够控制产品质量，确定所购买油的公平价格，进而让注重健康的消费者能够获得准确的标签。 

2. 研究方法 

作者从19,583 个油样品中提取脂质，涵盖从丰益生产工厂获得的十种食用油类型：花生油（GNO）、高芥酸菜籽油 （HERSO）、高油酸葵花籽油 （HOSFO）、低芥酸菜籽油 （LERSO）、亚麻籽油（LNO）、低油酸葵花籽油（LOSFO）、玉米油 （MZO）、米糠油（RBO）、大豆油 （SBO） 和芝麻油（SSO）。通过气相色谱和火焰离子化检测器（GC-FID）将脂肪酸衍生化并鉴定为脂肪酸甲酯（FAMES），从而可以鉴定和定量至少18种不同的脂肪酸。这个大型数据集的可用性使作者能够研究油类型之间和内部的变化。比较不同油型的脂肪酸谱，发现某些油类中存在主要脂肪酸。（例如，花生油表现出独特的 C20：0 和 C22：0 特征，高油酸葵花籽油表现出强烈的 C18：1 特征，亚麻籽油表现出独特的C18：3 特征（图 1）。

图1.10种植物油的脂肪酸分布即从C16:0:C24:1等16中脂肪酸的相对丰度

然而，许多其他油类型的脂肪酸谱和脂肪酸丰度存在相当大的重叠。此外，脂肪酸谱中存在多种模式表明模式异质性以及每种油种可能分解为亚型（图1）。随后使用最先进的降维算法进行的数据可视化 14 支持了这一假设，因为发现一些大型油组分散到较小的岛屿中（图2b）。相比之下，传统的化学计量学方法无法清楚地分辨出所有的油簇。通过在数据上拟合高斯混合模型 （GMM） 来广泛验证这一假设，假设数据点可以从有限数量的高斯分布的混合中生成。期望最大化算法的结果通过贝叶斯信息准则进一步优化，共产生16个聚类（图2）。

图2(b) 十种植物油PCA和GMM处理后分布(c)十六种脂肪酸PCA和GMM处理后分布

聚类被映射回维减潜空间，结果在很大程度上证实了10种纯油类型的身份。假设某些油类型被划分为更小的子簇，则无监督GMM模型推断的身份达到了99.9%的精度和灵敏度。因此，从10个较大的聚类中获得了16个子聚类，同一亚聚类中的样本在降维嵌入中空间共定位。这种共定位表明，亚簇内原始脂肪酸空间中的欧几里得距离小于亚簇之间的欧几里得距离，进一步支持了先前观察到的异质性是特定脂肪酸差异的结果的观点。为了进一步揭示油内子簇所描述的模式，我们将GMM参数与子簇的经验分布进行了比较（图3d）。

图3(d) 用数字标记的子簇的经验分布,主要脂肪酸变化在红色框中突出显示

作者使用葵花籽油的高油酸变体作为阳性对照，因为与低油酸变体相比，葵花籽油的C18：1含量明显更高。同样，与低芥酸变体（高亮绿色框）相比，菜籽油的高芥酸变体在 C22：1 中更为明显。这些观察结果支持了亚簇的观点。高芥酸菜籽油和低芥酸菜籽油可以分别进一步分为三个和两个亚簇。亚簇HERSO.2在空间上更接近LERSO簇，含有丰度与LERSO类型相似的脂肪酸（C18：1，C20：1），表明芥酸不是两个菜籽油品种的唯一鉴别特征。在其他亚簇中，SBO.1、SBO.2和SBO.3显示出脂肪酸C18：0和C18：1的协调变化。其中C18：1水平的降低与C18：0水平的增加相关。对于其他不常见的脂肪酸，例如C17：0，也可以看到亚簇中丰度的一些变化。综上所述，作者的结果表明，这些油的表型不同，多种脂肪酸的变化。这些差异是否可归因于地理来源或由于使用了不同的加工方法仍有待调查。

3. 研究结果

作者为了研究模拟油混合物的数据模式，比较了十种油类的大量模拟油混合物（见图4）。这一模拟结果表明，通过进一步的监督建模可以捕捉到广泛的混合趋势，而对于复杂的混合，预计会有较大的误差。

图4. 两种，三种和四种混合油的潜在空间。

（a–c）表示相对于主要油品测得的油品纯度。（d–f）使用十种颜色表示饼图中混合物的相对比例。a，b两种混合物中的十个中心描述了十种最纯净形式（红色）的食用油。如饼图所示，在另一种纯油类的中心，当两种油按等比例混合后，纯度变为50％（蓝色），然后又变回红色。尽管由于混合物的复杂性，中心变得更加模糊，但（c、d）三种和（e、f）四种混合显示出相同的组成。

作者总共生成了1200万个油混合物，用于构建和评价深度学习神经网络模型。结果表明，相比之下，深度学习模型对基于脂肪酸特征的未知油脂类型具有更强的归纳和区分能力。

图5. 机器学习原理图

作者表明单一的模型，可以量化任何两种混合，而不需要任何先验知识的组成，可以解决简单油掺假问题。将双向模型推广到三种和其他复杂混合物也可以快速识别这些掺杂物。从两个方面进一步论证了深度学习模型的普遍适用性。相比之下，当复杂性增加时，传统的化学计量学方法不能处理。其次，还进行了一项更真实的测试，其结果与模拟测试错误率非常接近。

图6. 花生油掺杂常见的三种油成分深度学习结果。地面真值由Gibb三角形表示，三角形中的每个点对应三种油的精确比例，总和一致(上图)。颜色是:三角形代表纯度，颜色的变化代表另两种油的混合比例。三种油混合深度学习模型预测的结果根据相对比例进行着色。

作者为了评估由中国生产线工厂生产的油构建的模型性能，另外收集了来自中国，印度，日本，南北美洲，非洲和中东各个地区的56种纯花生油。无监督分析表明，这些56种油与初始数据集的花生油聚在一起，显示出区域共定位。

图6. 用于在线训练的花生油。56种新来源的不同花生油用于在线训练的潜在空间中。收集的样本按地图上所示的地理分布，样本数量用红色圆圈表示。

实验表明在线更新深度学习模型参数是可能的。这一过程提高了模型对真实混合物的预测精度。在线学习在新加的油类的稳健性也在盲测中进行了测试，结果证明在线训练在提高性能和将普遍适用性扩展到新油和分馏油方面的有效性。

4. 研究结论

作者利用从大量油样中收集的一组统一的脂肪酸图谱，进行了一项全面的研究，通过整合机器学习技术，得出推断和预测。传统的有监督化学计量学方法缺乏通用性。创新点如下：(1)将有监督的深度学习机耦合到仿真过程，解决传统化学计量法不能判断多种油类掺假的问题。(2)通过在线学习，扩大了该模型在全球应用的范围。(3)引入与现有油品表型不同的新油品时，模拟过程可用于指导深度学习模型参数的更新。