免疫检查点阻断（ICB）疗法革新了癌症治疗，但许多患者对其无响应。肿瘤如何逃避免疫系统的攻击，特别是在复杂的肿瘤微环境中，仍是未解之谜。马萨诸塞州总医院与麻省理工学院和哈佛大学博德研究所团队通过大规模体内CRISPR筛选，系统性地揭示了跨癌种的肿瘤内在免疫逃避通路，并意外地发现，肿瘤自身的干扰素（IFN）信号通路通过经典与非经典 MHC I 分子双重调控，分别抑制NK细胞与CD8⁺T细胞功能，为破解ICB耐药提供了全新的分子靶点与治疗思路。
一、核心研究方法：体内筛选
为了克服体外培养系统无法模拟复杂肿瘤微环境的局限性，本研究采用了基因组尺度和亚基因组尺度的体内CRISPR-Cas9筛选技术。这是本研究的核心方法与最大亮点，具体方法如下：
1.模型选择：研究人员构建了8种可移植的小鼠肿瘤模型，涵盖黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、肾癌和结肠癌五种癌症类型，代表了不同的遗传驱动因素和组织来源，确保了研究结果的广泛性和代表性。
2.筛选设计：
将包含18,748 个基因的全基因组sgRNA文库在小鼠移植瘤模型中开展14项筛选，包括基因组尺度与亚基因组尺度筛选，待肿瘤生长后，回收肿瘤细胞，通过高通量测序分析sgRNA的富集或耗竭情况。
小鼠分组：
· 免疫缺陷（NSG）小鼠：作为对照，无免疫选择压力。
· 免疫健全（WT）小鼠：考察内源性抗肿瘤免疫的压力。
· 免疫健全且接受ICB治疗（WT+ICB）的小鼠：考察ICB增强的免疫压力。
3.数据分析：通过比较ICB组/WT组与NSG组中sgRNA的丰度变化，来鉴定“免疫依赖”基因。若某个基因被敲除后，sgRNA在免疫压力下耗竭，则该基因为“免疫敏感化”基因；若富集，则为“免疫抵抗”基因。
二、研究结果与发现
结果一：体内CRISPR文库筛选揭示新的免疫治疗增敏与抵抗机制
通过体内CRISPR文库筛选实验确认了许多已知的免疫调节基因，如Ptpn2、Pten、Casp8等。发现了大量新的免疫抵抗基因（如Ccar1、Ubr、Dot1l）和免疫敏感化基因（如 Calr、Rnf31、Med16）。当这些基因被敲除后，会分别导致肿瘤对ICB产生抵抗或变得更敏感。通过体内实验验证了其中部分新基因的功能，例如敲除Ccar1 使B16黑色素瘤抵抗ICB，而敲除Calr或Rnf31则使肿瘤对ICB更敏感。
图1.体内基因组规模的筛选揭示了免疫疗法的耐药性和敏感性的机制
结果二：意外发现—肿瘤IFN信号通路感知缺失竟能增敏免疫
对筛选出的耗竭基因进行通路富集分析和STRING网络聚类分析。并在KPC和CT26细胞中构建Jak1、Ifngr1、Ifnar1基因敲除模型，在体内验证其对ICB的响应。
结论：出乎意料地，IFN-γ和I型IFN信号通路的缺失，在大多数模型中使肿瘤对ICB更敏感。这与该通路在免疫监视中的经典作用以及某些临床耐药案例（如JAK1/2突变）相悖。Jak1的缺失（同时阻断I型和II型IFN信号）比单独缺失Ifnar1或Ifngr1产生的增敏效果更强（图2d,e）。IFN感知和抗原呈递通路被确定为肿瘤对免疫治疗敏感性的核心调节因子。
图2.IFN信号的缺失会使肿瘤对ICB更加敏感
结果三：IFN的免疫抑制作用依赖于MHC I类分子
为探究IFN信号通路如何抑制抗肿瘤免疫，研究人员通过RNA测序鉴定IFN刺激基因（ISG）；流式细胞术验证IFNγ能上调经典MHC I（H-2K/D）、非经典MHC I（Qa-1b，即HLA-E的小鼠同源物）和PD-L1；设计体内竞争实验，在Tap1或B2m缺失（导致MHC I类分子无法在细胞表面表达）的肿瘤细胞背景下，再次敲除Ifngr1或Jak1，观察其竞争优势是否消失。
结论：IFN信号通路的免疫抑制效应依赖于完整的MHC I类抗原呈递通路。当 Tap1或B2m被敲除后，IFN感知缺失的细胞不再具有竞争劣势。这表明，肿瘤通过感知IFN来上调MHC I类分子，从而获得保护，逃避免疫攻击。
图3.IFN介导的抗肿瘤免疫抑制作用取决于MHCⅠ类分子的呈递作用
结果四：ICB激活的CD4+ T细胞和NK细胞是清除IFN感知缺失肿瘤的关键
为确定是哪些免疫细胞亚群负责杀伤IFN感知缺失的肿瘤细胞，研究人员在荷瘤小鼠中分别耗竭CD8+ T细胞、CD4+ T细胞或NK细胞，观察对Jak1 缺失肿瘤ICB疗效的影响。利用单细胞RNA测序分析ICB治疗后肿瘤浸润淋巴细胞的变化。进行体外共培养实验，验证NK细胞是否能特异性杀伤 Jak1 缺失的肿瘤细胞，以及这种杀伤是否依赖于肿瘤的MHC I表达。
结论：CD4+ T细胞和NK细胞，而非CD8+ T细胞，是清除IFN感知缺失肿瘤的主要效应细胞。单细胞测序显示，ICB治疗激活了一个表达PD-1和CTLA-4的TH1型CD4+ T细胞亚群。体外实验证实，活化的NK细胞能优先杀伤Jak1缺失的肿瘤细胞，而这种杀伤效应可被肿瘤细胞上经典MHC I分子（如H2-K1）的表达所抑制。
图4.ICB激活CD4+ T细胞和NK细胞，消除IFN传感缺陷肿瘤
结果五：肿瘤IFN感知通过Qa-1b抑制细胞毒性CD8+ T细胞
为了探究在筛选中最强悍的基因之一——编码非经典MHC I分子Qa-1b的H2-T23 的作用机制，研究人员在多种模型中敲除 H2-T23，验证其对ICB疗效的影响。在原本不依赖 H2-T23 的MC38细胞中强制表达Qa-1b，观察其是否获得抵抗性。通过免疫细胞耗竭实验确定Qa-1b主要抑制哪种免疫细胞。利用单细胞测序和流式细胞术分析CD8+ T细胞上Qa-1b的受体NKG2A/CD94的表达。使用CAR-T细胞模型，将T细胞的抗原识别与MHC I上调解耦，专门研究Qa-1b/NKG2A轴的抑制作用。
结论：Qa-1b是跨癌种保守的关键免疫抑制分子。其缺失使肿瘤对ICB更敏感，其过表达则导致抵抗。Qa-1b主要抑制的是CD8+ T细胞，而非NK细胞。ICB治疗诱导活化的、终末分化的效应性和耗竭性CD8+ T细胞高表达NKG2A/CD94受体。肿瘤IFN信号通过上调Qa-1b，与CD8+ T细胞上的NKG2A结合，直接抑制了CD8+ T细胞的杀伤能力，这一机制在CAR-T细胞杀伤实验中得到完美证实。
图5. Qa-1b/NKG2A是ICB诱导的CD8+ T细胞免疫检查点
结果六：临床关联——治疗后IFN特征与ICB抵抗相关
分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库，发现人类6p21.3基因座（包含 TAP1, TAP2, HLA-E 等MHC I相关基因）的缺失在多种癌症中常见。分析肾癌和黑色素瘤患者队列，研究IFN特征与生存预后的关系。在黑色素瘤队列中，动态分析患者接受ICB治疗前后血清中ISG蛋白水平的变化。
结论：IFN信号的作用具有免疫背景依赖性。在富含NK细胞应答的环境中，高IFN特征预示不良预后；而在T细胞主导的环境中，则可能预示良好预后。治疗6个月后，无应答者血清中的ISG蛋白（包括IFNγ和HLA-E）水平持续升高，且高ISG水平与更短的无进展生存期显著相关。这表明IFN介导的适应性抵抗是导致ICB治疗失败的一个重要机制。
图6.IFN炎症与黑色素瘤的免疫治疗耐药性有关
三、总结与展望
本研究通过跨癌种体内CRISPR筛选，首次构建了肿瘤免疫逃逸的全景图谱，核心突破在于揭示了IFN信号通路的“双刃剑”作用——传统认知中IFNγ是抗肿瘤免疫的关键分子，而本研究发现肿瘤内在IFN信号通过经典 MHC I 抑制NK细胞、非经典MHC I（Qa-1b/HLA-E）抑制CD8⁺T细胞，形成双重免疫逃逸屏障。
这一机制为ICB耐药提供了全新解决方案：一方面，靶向Qa-1b/NKG2A轴可直接解除CD8⁺T细胞抑制，与ICB联合发挥协同作用；另一方面，血清ISG蛋白水平可作为临床预后预测标志物，实现患者精准分层。未来，针对IFN-MHC轴的联合疗法（如NKG2A抑制剂+抗PD-1）有望打破现有治疗瓶颈，为更多耐药患者带来希望。
参考文献：Dubrot J, Du P P, Lane-Reticker S K, et al. In vivo CRISPR screens reveal the landscape of immune evasion pathways across cancer[J]. Nature Immunology, 2022, 23(10): 1495-1506.
技术服务：CRISPR/Cas9细胞基因编辑、载体构建/文库病毒、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰
细胞试剂：HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清