免疫酶细胞化学技术

免疫酶细胞化学是免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助千酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原／抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术。60年代初Nakane和Pierce，Avrameas和Uriel等成功地把辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体分子上，从而开创了酶标记抗体的新技术。

Sternberger（1970）等人在此基础上又作了改良，建立了非标记抗体酶法以及PAP法。酶标抗体法确立至今已经30个春秋，不断发展、成熟。各种新技术的引入，使新抗体相继问世，应运而生的抗体制造、经销商遍布世界各地，使ICC技术得到了更广泛的推广和应用，成为当今形态学领域中不可缺少的手段；同时也能为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供重要依据，是临床实验室常规检查法之一。伴随分子生物学、分子遗传学的惊人进步，ICC技术在基因表达产物的检查，细胞功能动态分析中，亦发挥着重要作用。在此，介绍ICC染色中的主要程序：组织标本的固定、切片、染色原理及步骤、结果判定及特殊应用等。

 

第一节  组织的固定和切片

一、固定

若想得到理想的ICC染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好的酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（immobility）和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是ICC染色中非常重要的一环。ICC与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织抗原的免疫活性。一般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。Cunrming（1980）报告，不固定的组织切片ICC染色时，环鸟昔酸含量丢失80％以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白质等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的关键一步。用于ICC的固定剂种类较多，选择时应根据所需检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。

（一）AMEX法

AMEX（acetone meth enzoate xylene）法是改良的冰冻置换法（freeze substitution）的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato（1986）报告，该法具有同新鲜（未固定）组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞内水分逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20℃丙酮内过夜亦形成冰品，所以原方法将组织先置4℃丙酮20~30分钟，再移入-20℃丙酮过夜。实际上组织在4℃丙酮内过夜亦可得到同样效果。

（二）微波固定

微波固定（microwave fixation）能保持良好的组织结构和抗原性，适于各种切片的酶组化、ICC以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与微波的频率（1000~3000 MHz）具有被水分吸收的性质（通常所用的微波是周波数2450 MHz，波长12cm）;生物材料含有大量水分，照射后，分子运动加快，温度升高，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内达到固定的效果等，经微波照射固定的组织，需置相同固定液中，室温继续固定2~6小时。

专门固定用的微波炉例如：Bio-Rad H2500型、日新EM·MWE2等，能够准确地调节照射时间和测定被照材料的瞬时温度。利用家庭微波炉代替时，应选用能以秒为单位调控的微波炉。实验材料的不同，所需固定液的量、照射时间等各异，所以应在预实验的基础上，找出合适的固定液量、照射时间和温度、多数实验室的条件为：固定液5~10毫升，照射10~30秒，照射后固定液的温度<50℃。其方法为：将实验标本置于微波炉旋转台的中央，周边放一烧杯盛300~500毫升纯水，吸收照射时炉内产生的热量，选择强档照射10~30秒。接通电源（on）至微波产生利用超声波代替微波照射，或二者并用，照射后，组织标本和固定液的温度升高较少，亦能获得短时间内良好的固定效果（Yasuda，1992）。

二、切片

光镜ICC染色，常用的有冰冻切片和石蜡切片两种，二者各有其优缺点，应根据抗原的性质、实验室条件，合理选择之。对未知抗原显示时，最好同时应用。冰冻切片为ICC研究所首选。

Shi（1991）等报告：微波炉照射的切片，能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高热的作用，使核内DNA双链解开，DNA、RNA解离，抗原暴露有关。其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，反复多次照射，每次1分钟，照射5~10次，每次照射后，补充瓶中蒸发掉的液体，照射温度不超过90~95℃为宜，处理后，细胞以苏木精染核。

 

第二节  酶的标记与染色方法

一、酶标抗体法

酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，在光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。

（一）酶的种类及特点

从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表1，供选用时参考。

 

 

表1 免疫细胞化学常用的酶

名称

 

分子量（kD）

内源性

商品

 

Horeseradish peroxidase

 

40-45

＋

有

 

Aikaline phosphatase

 

80-120

++

有

 

Acid phosphatase

 

100

+++

有

 

 

Glucose oxid邸e

 

160-190

 

有

 

Sternberger（1986）指出，用于标记的酶应具备以下六点：①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；③获得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，活性不应改变，且酶的催化活性（turnover）越高越好；⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不影响二者的活性；⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶。

其中，①②两点甚为重要，因为并非容易显示的酶均有形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）较佳，是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根内含星最丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卧琳结合组成的一种糖蛋白，糖占16~18%（8条糖链分布在HRP分子表面），分子量40kD，最适pH5~5.5，最适温度40~45℃；pH4~ll，50℃以下均较稳定，易溶于水和58％以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含铁卟啉，称辅基，最大吸收光谱为403纳米，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光谱为275纳米，HRP的纯度是用二者的光密度比值（OD403/275）衡量，Reinheit Zahl（RZ）表示。一般认为，标记酶的RZ值为3.0左右，不应小于2.8，R值越小，酶的纯度越差，例如RZ值为0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高达75%。对于纯度低、质量差的酶，需纯化后使用。

除HRP外，碱性磷酸酶（alkalinephasphotase，ALP）和葡萄糖氧化酶（glucoseoxidasc，GOD）也较常用。ALP分子量约为HRP
2~3倍，最适pH9.0~9.5左右，比较稳定，内源性ALP也较易消除，大部分均可被左旋咪唑（Levamisole，分子量240.8kD）抑制，但肠粘膜表面的内源性ALP活性不受影响。目前所用的ALP大多系由牛的肠粘膜提取制得，所以肠粘膜等呈强阳性反应。

ALP最初是由Bulman等用于标记抗体的。选用不同的底物，可形成不同颜色的终产物，例如以萘酚AS-MX和快监（fast blue，FB）为底物，生成蓝色沉淀。用快红（fast red，FR）代替FB，形成红色不溶沉淀e与HRP/4-氯-l-萘酚（CN）或DAB形成的沉淀形成鲜明对比。但FB、FR等的沉淀溶于有机溶剂，不能进行脱水、透明等处理。利用新品红（new
fuchsine）显色，形成的红色沉淀产物不溶于有机溶剂，不褪色，核复染后，可制成永久性保存标本。

附：配制萘酚-AS-MX缓冲液：将萘酚-AS-M×2毫克溶于二甲基甲酰胺0.2毫升，再加0.1mol/LTris缓冲液（pHS.3）9.8毫升。此缓冲液在4℃下可存放数星期。用前再加入坚固蓝BB（1毫克/毫升）。切片用此液染10~15分钟，Tris-缓冲液洗。

GOD所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基四唑蓝（P-Nitrobluetetra幻liUill），终产物为不溶性的蓝色沉淀，比较稳定。从理论上讲GOD较ALP、HRP为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性GOD，但其分子量较大，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶的活性，故GOD主要用于ICC双重染色。

（二）酶标抗体的制备

酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥–偶联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，具备3个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结；②偶联剂不应影响酶和抗体的活性；③不能因偶联剂的加入，使酶标抗体与组织成分发生非特异结合。

在HRP标记抗体中，常用的偶联剂有戊二醛、对萘醌（aphthalenedione）、过磺酸钠及Maleimide（马来酰亚胺）等，现简述如下。

1.戊二醛标记法

戊二醛为制备各种酶标抗体最常用的偶联剂。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯酸及戊二醛自身聚合体等杂质，故需纯化后使用。戊二醛的纯度用含杂质的戊二醛和单体戊二醛的OD比值表示，它们的最大吸收光波长分别为235纳米和280纳米，二者的OD比值（235/280）小于3时，制备酶标抗体的效果较好，大于3时，需经蒸榴或Sephadex G-10柱层析或活性炭吸附等处理，除去杂质后应用。其制备方法分一步法和两步法；基本原理相同，是戊二醛基之一与酶蛋白的赖氨酸结合，另一醛基与免疫球蛋白上的氨基结合，将酶连接于抗体上。

（1）一步法：将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的）戊二醛，制得酶标抗体。优点是简单省时，缺点是反应程度不易被控制，因为酶蛋白分子和抗体蛋白分子同戊二醛间的反应速率不同，抗体蛋自的氨基数远较HRP为多，与戊二醛反应快，因此在戊二醛的作用下，抗体蛋白易通过分子内和分子间的彼此交联，形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记。据Nakane等推算，加入的HRP仅20％与抗体连结，标记率较低，很难获得理想的酶标抗体。

（2）二步法：首先用过卧的戊二醛与HRP反应（HRP）戊二醋为1:10勺，以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离；然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛复合物），再加入过量的抗体，使活化HRP上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过星的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的HRP与抗体（IgG）比例不同，酶标记率各异，平均为5~25%。标记步骤如下：

1）HRP（RZ=3.0）10毫克，溶于l.25％戊二醛（0.1mol/L磷酸缓冲液配制）0.2毫升中，18小时，室温。

2）透析或Sephadex G-25柱层析（0.15mol/LNaCl平衡），去除过量的戊二醛，收集活化HRP。

3）浓缩活化HRP至10毫克/毫升左右，加入抗体5毫克（0.15mol/LNaCl溶解1.0毫升）。

4）碳酸盐缓冲液（pH9.5）调整pH至9.0~9.5，使抗体与HRP结合，4℃ 24小时。

5）加入赖氨酸缓冲液0.1毫升，阻断未反应的醛基，4°C，2小时。

6）用半饱和硫酸桉沉淀3次，5000转/分钟（rpm）15分钟在PBS透析24小时，4°C，换3次PBS，除去硫酸铵。

7）或用凝胶色谱法（Sephadex G-200/Sephacryl
S-400）等分离标记抗体。

注意：该方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体；而RZ值小于2.8的HRP，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。

2.过碳酸盐氧化法

严格地讲，过碳酸钠（sodium periodate）不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助千过磺酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适千含糖较丰富的酶

（如HRP）的标记。我们知道，HRP分子的糖本身与酶活性无关，利用过碳酸钠氧化这部分糖分子内的-CH基，使之生成-CHO基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成Shiff碱。此Shiff碱在 pH降低时呈可逆性解离，所以经氢堋化钠（NaB凡）还原，形成稳定的酶标抗体复合物（图23-1）。为防止生成的-CHO基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯（dintro-fluorobenzene）处理HRP，阻断分子内的ε、α–氨基。

过碘酸盐氧化法，酶的RZ值 3时较佳；RZ<3时，糖含量较少，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量。据报告，适当地控制过澳酸盐溶液及反应条件，使加入的 HRP和抗体均形成酶标抗体，其标记率为70％左右。具体步骤为：

图1过碳酸盐氧化原理

（1）HRP（RZ=3.0）4毫克溶于双蒸水1.0毫升中。

（2）加新鲜配制的0.1mol/LNaIO4（高碘酸钠，Sodium Periodate）0.2毫升，轻轻摇动混合20分钟，肉眼可见液体由棕黄变成深绿色。

（3）对0.1mmol/L醋酸盐缓冲液（pH4.4）透析，20小时，4°C。

（4）调整H即液体的pH至9.5（一般加入0.2mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5 20微升），立即加入抗体（IgG）8.0毫克/Fab 3.0毫克（0.0lmol/L碳酸盐缓冲液溶解），轻轻混匀后，置室温2小时。pH≤8.5时，抗体的-NH2被氧化生成NH3+，后者不能与CHO基反应，所以，保持pH 9.0~9.5非常重要。

（5）加入新鲜配制的0.4% NaBH4（硼氢化钠、四硼氢化钠，Sodium borohydride）溶液0.1毫升，置1~4℃
2小时，以稳定酶标抗体复合物。

（6）经透析等去除未反应的NaBH4，避免还原过度。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体（方法同戊二醛法）。

如此制得的酶标抗体，加入终浓度1％牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），分装后于-80℃可保存数年；亦可加入10％等量甘油，混匀置-20°C、4℃保存1年左右。

上述两种标记法是ICC研究中最常用的酶标抗体制备方法。

3.N-羧基丁二酰酯法

上述酶标抗体（IgG）的分子量较大，对抗体的穿透性有一定影响，而在制备过程中，需经两次纯化，即多聚体与单体及单体与非标记抗体的分离。已知单体（1个HRP标记1个IgG分子）的分子量为190~200kD，非标记抗体为146~150kD，用凝胶过滤法很难将二者分开。所以，Sternberger等进行了抗体片段Fab的标记。用木瓜酶（Papain）水解抗体蛋白，可获得一个无抗体活性稳定的Fc段结晶和两个相同的抗原结合片段（Fab），此Fab段为单价，分子量50kD，H团）标记后，单体分子量为90kD，较容易将单体和非标记的Fab段分离。在此基础上，lmagawa（1982）又进行了改良，引入了N-羟基丁二酰酯（Maleinmide），标记抗体的特定部位——Maleinmide法。该方法的主要原理是：

（1）借助双功能试剂Maleinmide活化HRP，使其具有与-HS基反应的能力；

（2）利用胃蛋白酶水解IgG，IgG重链在近羧基端被切断，这样在绞链区（hinge region）至少可以保留一个S-S键，从而得到一个具有双价抗体活性的F（ab’）2段。该S-S键与抗体活性无关，可以通过加入琉基乙醇（β–）（Mercapto ethanol），HSCH2CH2OH使其断裂，被还原成-HS基。如此双价抗体活性的F（ab’）z片段即变为带有-HS基的单价Fab’片段，后者再与活化的HRP结合，使制成了酶标抗体Fab’。由于空间遮蔽的关系，绞链区即使存在两个-HS基，也只能有一个能与酶结合，另一个-HS基不能与酶反应，即酶与抗体Fab’段结合比例为1:l，因此酶标记抗体Fab’段绝大多数是单体，很少形成多聚体。在标记过程中，应用过量的活化HRP，还能避免非标记抗体Fab’段的存在。Fab’段的分子量与Fab段相似（50kD左右），所以酶标后Fab’段亦较容易与未标记的Fab’分离。此标记方法多用于酶免疫分析研究，其步骤为：

1）HRP6毫克溶于PBS（pH7.0）1.0毫升中。

2）Maleinmide 4毫克溶于N，N二甲基酰胺（N，N’-demethylformamide）0.5毫升中。

3）将上述两种液体充分混合，持续搅拌1小时，30℃。

4）离心取上清，经0.1mol/LPB（pH6.0）平衡的Sephadex G-10柱层析，收集含有蛋白部分的洗脱液，浓缩，制得活化HRP。

5）每1.8毫克活化HRP，加入已被还原的Fab’2毫克，4℃ 20小时持续搅拌。

6）Sephadex G-200/Sephacryl S-400分离酶标抗体Fab’片段，保存同前。

（三）酶标抗体的纯化

上述各种方法制备各酶标抗体时，除产生酶标抗体外，还有未标记的抗体蛋白、游离酶、酶二聚体及偶联剂等。这些均可使酶标抗体的敏感性下降，故酶标抗体须经纯化后应用。现简介几种常用的纯化方法。

1.多聚体的分离

实验中，不同的试剂形成多聚体的数量各异，即使同样的实验药试剂和程序，在不同的时间制备的酶标抗体中，多聚体的数植亦不相同。多聚体较单体含酶量多，与组织的非特异吸附增强，使方法的敏感性下降，故用前必须除去多聚体。以凝胶过滤法分离多聚体的效果较好。

2.非标记抗体的分离

非标记抗体与标记抗体具有相同的免疫学特征，能竞争与组织特异抗原结合，而且亲和力较标记抗体强，首先与组织抗原结合。一般认为每个抗体连结1~2个酶分子，并不影响抗体的两个（Fab）抗原结合点，但因存在空间遮蔽现象，一个Fab段与组织特异性抗原结合后，可能抑制另一个Fab段与组织抗原结合，故标记抗体仅通过一个Fab段与抗原结合。非标记抗体则不存在这种现象，两个Fab段均与抗原结合，因而亲和力较强。所以酶标抗体在应用前须用琼脂糖亲和层析等方法去除非标记抗体。

3.亲和层析

利用蛋白A（Protein
A）/琼脂糖–刀豆素A（Concanamycin A）/琼脂糖亲和层析柱能制得较纯的酶标抗体。因为蛋白A与抗体（标记和未标记）间有较强的亲和力，不与HRP结合。而刀豆素A与HRP（标记和游离）间的亲和力非常强，不与抗体结合。据此二者并用，能获得较纯的HRP酶标抗体。该方法省时，分离能力强（约为凝胶层析的600倍）。但有一定的局限性，因为蛋白A并非与所有种属的免疫球蛋白结合，例如：不能与羊的免疫球蛋白结合，所以难以用于纯化羊的酶标抗体。而刀豆素A与HRP的亲和力极强，甚至呈不可逆性结合，可使部分酶标抗体的活性丧失。

（四）染色原理及步骤

1.基本原理

酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（多数抗血清系由家兔制得，单克隆抗体系由小鼠制备）；

第二抗体则为第一抗体的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同标记的第二抗体结合就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以间接法为常用，在此着重介绍间接法的染色。

2.染色程序

细胞核的染色，以甲基绿和苏木精为常用。前者细胞核呈绿色，与HRP/ALP等终产物对比度尤佳，但不适于微波照射的标本。苏木精是组织学、病理学研究中普遍应用的核染色方法，与HRP、ALP的终产物对比度也很好。

DAB呈色的标本，可经系列酒精脱水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物质呈色的标本，在有机溶剂中沉淀物易溶解、褪色，所以用水溶性封固剂如明胶甘油等封固，次H，在盖玻片周围涂少许指甲油，可使切片保存时间更长。

3.酶标抗体显色原理及显色剂的选择

（1）HRP（辣根过氧化物酶）:为ICC染色中最为常用的酶。其呈色原理如下：

表2 辣根过氧化物酶常用的供氢体

供氢体

反应产物

颜色

水溶解度

邻联二茴香胺（联大茵香胺）

深棕色

部分溶解

邻联二茴香盐酸盐

桃红色

（奶状物）

邻联甲苯胺

蓝色

小，不稳定

邻苯二胺

深桔黄色

大

5-氨基水杨酸

紫褐色

小

5-氨基-2羟基苯甲酸

棕色

小

联苯胺

蓝色

不溶解

3，3-二氨基联苯胺（DAB）

棕色

不溶解

3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）

红色

不溶解

甲萘酚

红色

不溶解

甲萘酚派洛宁

桃红色

不溶解

4-氯-1-萘酚

灰蓝色

不溶解

四甲基联苯胺

蓝色

不溶解

 

HRP特异底物为H2O2，在分解H2O2过程中，与H2O2形成复合物，尤电子供体存在时，反应再进行，当电子供体存在时，迅速生成水，酶被还原，电子供体被氧化、聚合，再经氧化环化后形成吲哚胺多聚体。红外分光分析表明：此多聚体进一步氧化环化，形成苯乙肼聚合体（图2）。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。

HRP即催化的酶促反应第一步是特异的——酶催化底物H2O2，其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体，可使终产物呈不同颜色，例如：CN（4-氯-1-萘酚，4-chloro-1-naphthol）为蓝黑色，TMB（四甲基联苯胺，tetramethyl-benzidine）为深蓝色，AEC（3-氨基-9-乙基卡巴唑,3-amino-9-ethyl-carbazole）为红色。市售试剂盒所配显色液以AEC居多，室温下较稳定，但不能进行脱水等处理，时间长易褪色。DAB是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明、永久保存，且终产物具有嗜锇性，经锇酸（OsO4）处理，电子密度增加，适于电镜下确定抗原的存在部位。但是DAB被认为可能具有致癌性，所以应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存。应用时淀，故显色应在暗处进行。

图2 DAB反应产物形成过程

稀释、过滤。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。

（2）ALP（碱性磷酸酶），是以AS-MX为底物，FB/FR为发色剂，生成蓝色／红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。显色液内加入终浓度为2~4mmol/L的levamisole（左咪唑），大多数内源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levarnisole）以每亳升60~120mmol/L浓度的贮存液-20℃冰箱保存。应用时稀释30倍。为避免反复称取，试剂吸水，禁酚-AS-MX、FR、FB试剂均应小量分装后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液20毫升计算，分装AS-MX 5~8毫克／支、FR 8毫克／支，FB 8毫克／支，每次使用一次，用前稀释30倍，过滤显色。FR、FB等在光照射条件下易引起沉淀。故显色应在暗处进行。

〖病理学技术〗免疫酶细胞化学技术

（3）GOD（葡萄糖氧化酶），是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67毫克、NBT 6.7毫克、PMS（吩嗪硫酸甲酯，Phenazine Methylsulfate） 0.167毫克，0.05mol/LPB（pH8.3） 10.0毫升，37℃孵育l小时。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但GOD的敏感度较HRP和ALP为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法的敏感性和特异性。即用GOD和HRP分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为CX）D标记的兔抗鼠lgG，第三抗体则为HRP标记的羊抗兔IgG），ICC染色，以葡萄糖-DAB作显色剂。基本原理如（图3）。在这里HRP是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化对生成的H2O2作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且GOD和HRP所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：

①切片经第一抗体孵育；②振洗，GOD标记的第二抗体孵育40~60分钟（37℃）;③振洗，HRP标记的第三抗体孵育45分钟（37℃）;④振洗，显色、脱水透明观察。

图3两步酶催化反应原理

二、非标记抗体酶法

由于酶标抗体存在一些缺点，例如酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxidase method，PAP法）。

（一）酶桥法

1.基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后利用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体上，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，又能节省第一抗体的用量。

2.染色步骤 主要程序如图4。

图4 酶桥法主要染色步骤

(1)切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24小时（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，振洗时不易丢失。

(2)切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属A IgG抗体）孵育l小时（37℃）。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。

(3)切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育l小时（37℃）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。

(4)切片与酶（HRP 80微克/毫升，PBS溶解）孵育0.5小时（37℃），酶与抗酶抗体结合。

(5)显色等，与酶标抗体法相同。

酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲和力和高亲和力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖千桥抗体对它的亲和力，而与其本身对酶的亲和力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲和力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70％左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此Sternberger（1970）又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。

（二）过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxidase method，PAP法）

1.PAP的制备及特征

PAP复合物是离体制备的H团甘亢HRP复合物，它的制备方法较多，现介绍其中之一。

（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0公斤以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10毫克），1周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0毫升乳化福氏完全佐剂（含HRP2毫克RZ=3.0）；间隔2周第2次注射，背部注入含HRP2毫克的不完全福氏佐剂1.0毫升;再间隔2周，第3次注射，2毫克HRP（溶于生理盐水2毫升中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP 0.1毫克/毫升）为1:128以上时，颈动脉放血，制备血清低温保存备用。

（2）制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与H团汀杉成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3）。

步骤：

l）取抗HRP血清10毫升，加含8毫克HRP（1.0毫克/毫升）的水溶液8毫升。

2）混匀，室温l小时后，离心3000转/分钟4℃ 15分钟。

3）0.9% NaCl（冷盐水）溶解沉淀，离心16000g 4℃ 15分钟，重复4次。

离心力（G）和转速（RPM）之间的换算：

G=1.11×10-5×R×(rpm)2

其中，G为离心力，一般以g（重力加速度）的倍数来表示。R为半径，单位为厘米。

例如，离心半径为10厘米，转速为8000RPM，其离心力为：

G=1.11×10-5×10×（8000）2=7104

即离心力为7104g.

而当离心力为8000g时，其转速应为：8489即约为8500rpm。

4）加HRP水溶液（含HRP 30.64毫克）15.3毫升，室温，持续搅拌。

5)用lNHCl及0.1N HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用lN及0.1N NaOH调 pH至7.2。

6)慢慢加等体积的饱和硫酸铁，置40℃45分钟。

7)离心5000rpm 0℃15分钟，用50％硫酸铵漂洗两次。

8)用10.50毫升水溶解沉淀，在透析液丙（NaCl48.6克，1.5N NaOOCCH3 30毫升，3N（NH4）2SO430毫升，水5.94L）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10毫升，分装低温保存。质量鉴定制备的PAP复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定PAP复合物的质量。常用分光光度计检测 PAP复合物在280纳米（IgG的最大吸收波长）和400纳米（HRP最大吸收波长）的光密度值（OD值），按下式计算IgG和HRP的含量：

一般HRPI抗HRP克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的PAP复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的PAP复合物不稳定，4℃可保存2~3周。最好临用前配制。

PAP复合物的特征

PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRPI抗HRP之比绝大部分为3:2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11.5秒，分子量为400~430 kD，由此可推算出酶与抗体之比为3:2，即每个PAP复合物由3个H团）分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为印守，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2-DAB显色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21纳米。这种结构非常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108′在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性（图5）。

图5 过氧化物酶–抗过氧化物酶复合物（PAP）主要由三个过氧化物酶和两个抗过氧化物酶亚单位所组成的一个五角形复合物

2. PAP染色原理及步骤

（1）原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法（图6）。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。

图6 PAP法主要染色步骤

（2）染色步骤

l）切片脱蜡，经各级酒精，水洗。

2）0.3% H2O280％甲醇液处理切片30分钟，室温。

3）水洗，PBS洗5分钟×2。

4）用5％正常羊血清处理切片30分钟，室温。

5）吸去羊血清。

6）加第一抗体（兔），在4℃中反应13~24h。

7）用PBS振洗5分钟×2。

8）加羊抗兔IgG抗体，在37℃中45分钟。

9）用PBS振洗5分钟×2。

10）加PAP（兔抗酶抗体制作），在37℃中45分钟。

11）用PBS振洗5分钟×2。

12）用DAB-H2O2底物显色5~30分钟。

13）自来水充分洗净。

14）对比染色。

15）脱水、透明、封固。

对照：可作空白、替代（第一抗体和桥抗体）及吸收等试验。

为了克服PAP法第一抗体及PAP必须来源于同种动物的限制，可用葡萄球菌A蛋白作桥抗体或用4步PAP法如第一抗体为鼠lgG单克隆抗体，而又无鼠PAP时，则可先用兔抗鼠再用羊抗兔桥抗再加兔PAP称为四步PAP。效果较好。

图7 双PAP法的两种放大机制

3.双PAP法（图7）

l）切片脱蜡，经各级酒精，水洗。

2）0.3% H2O280％甲醇液处理切片30分钟，室温。

3）水洗，PBS洗5分钟×2。

4）用5％正常羊血清处理切片30分钟，室温。

5）吸去羊血清。

6）加第一抗体（兔），在4℃中反应13~24h。

7）用PBS振洗5分钟×2。

8）加羊抗兔IgG抗体，在37℃中45分钟。

9）用PBS振洗5分钟×2。

10）加PAP（兔抗酶抗体制作），在37℃中45分钟。

11）滴加羊抗兔IgG血清（比第一次稀释大1倍）于切片上，37℃ 45分钟。

12）PBS振洗5分钟×2。

13）滴加PAP（比第1次稀释大1倍）于切片上，37C 45分钟。

14）对比染色。

15）脱水、透明、封固。

4. PAP法的评价

PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：

（1）抗体活性高  非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。

（2）灵敏度高灵敏度  是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1:1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/noise，SIN）表示。Sternberger（1979）认为PAP法较间接法敏感20~25倍，可进一步稀释第一抗体，以节省其用量。但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而间接法阴性时，PAP法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。另外，PAP复合物分子量较大（400kD），冰冻切片时，对组织的穿透性远不如酶标抗体（分子量90~180kD），所以不适于免疫电镜的标本制作。

（3）背景染色低在酶标抗体法中，被标记的非特异性抗体可与组织成分结合，造成背景染色（图8）。从理论上讲，在非标记抗体法，连结抗体中，即使存在着非特异性抗体，因其不是抗第一抗体种属IgG的特异性抗体，故不能与抗HRP抗体结合，不能把PAP复合物连结在非特异性抗体上（图9）。当然，PAP复合物内也可能存在些非抗HRP的抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，由于其不是抗HRP的抗体，故不能与HRP结合，无酶活性。桥抗体的引入，使ICC的特异性得到了双重放大，SIN增大。但也有人认为，过量的桥抗体及PAP复合物等均易与Fc受体结合，致使背景染色增强。实验表明：合适的切片准备、恰当地应用封闭性阻断剂、正常血清以阻断非特异性结合，加之适当地选择抗体稀释度和抑制内源性酶活性，PAP法和间接法二者的背景均相当低。

图8 间接酶标抗体法背景染色增高原因

图9 PAP法降低背景的原理

（4）假阴性及其处理  应用PAP法显示抗原含量较多的组织或冰冻切片组织抗原保持良好标本时，可导致假阴性结果，这种现象称为假阴性。Vandesand发现，应用PAP法显示大鼠穿室上核及室旁核内升压素神经细胞分布时，第一抗体（1:200）染色，加压素含有细胞呈强阳性。如果取材前24~48小时，脑室内注射秋水仙素，阻断轴突运输以增加视上核和视旁核升压素含量，同时组织标本经脱水、透明、再水化等处理以增加抗体的通透性，同样稀释度染色，结果却阴性。进一步实验发现：增加抗体的稀释度，开始出现阳性染色，稀释至1:1500时，染色最强，继续增加抗体稀释度，染色强度则下降。Bigbee（1977）认为假阴性是第一抗体用量过高与组织抗原结合过多，使相邻两个抗体的Fc段间的距离恰好是连结抗体的两个Fab段与之结合的长度，于是连结抗体不存在游离Fab段，仅剩无活性的Fc段，所以不能将PAP复合物连结在与组织抗原结合的第一抗体上，结果阴性。因此，借助PAP法研究组织抗原分布，特别是新鲜组织冰冻切片组织抗原保存较好时，第一抗体尽量用高稀释度，避免假阴性。石蜡切片很少发生这种现象，所以PAP法在石蜡切片的ICC观察中更为常用。

（5）桥抗体也称连结抗体，它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合能力。因此，当第一抗体和PAP复合物中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个Fab段之一与第一抗体结合、另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白A（SPA）代替桥抗体，进行ICC染色。SPA不受种属限制，应用范围广。

（6）PAP复合物  在PAP法及酶桥法中，特别强调第一抗体和抗HRP必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起。但一些研究表明：第一抗体和抗H团汁亢体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如Erlandsen发现豚鼠IgG作为第一抗体，可用羊抗兔lgG、兔PAP复合物显示之。Grzanna（1982）根据这一报告，利用豚鼠抗DBH血清作为第一抗体，羊抗兔IgG为桥抗体，12例兔血清制得的PAP复合物中，仅3例染色较佳。这种第一抗体和PAP复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体的种属交叉反应是有限的，也是不完全的。故利用桥抗体进行ICC染色时，仍以第一抗体和抗酶抗体来自同一种属为佳。

第三节  染色结果及判断

ICC染色结果判断与其它组织化学相似，应在熟悉所用方法、抗体的优点和局限性的基础上，避免主观意识，进行客观判断。一般认为在严格操作、控制染色条件，选择特异性抗体等条件下，所得结果是阳性时才有积极意义。而阴性时，不一定意味着该物质或抗原不存在，即不能排除实验过程所致的抗原丢失或抗体选择不当等引起的人工假象。另外根据ICC染色强弱做半定量分析时，必须是同时固定、相同的组织块、相邻同一切片，在严格控制抗体用最和显色时间等条件下，进行图像测定，否则无法相互比较。镜检时，首先从对照标本开始，判断固定是否合适、非特异性着色强弱等，再从低倍至高倍顺序观察实验标本，预期阳性部位是否被染色，不该含此类物质的部位是否阴性等。一般认为，切片边缘的较强染色，属于非持异性着色，所以应避免作为阳性结果的依据。同时应结合对照实验、鉴别假阳性，以便做出正确判断。

一、对照实验

（一）吸收实验

应用尚无文献报告的抗血清／自己制备的抗血清进行ICC染色时，需用相应的饱和抗原吸收抗血清后，再孵育标本，判断结果的可信性（结果应为阴性）。常用的吸收实验分固相吸收和液相吸收两种，对千不能形成沉淀，难以用离心沉降法分离的一些小分子多肤类抗原，以固相吸收为佳。一般市售抗体均经特异性检测，所以应用购买抗体时可省略此步骤。

（二）交叉实验

我们知道，引起机体免疫应答反应的并非是免疫原整个分子，而是其中的一部分一抗原决定簇。每个抗原可能有不同的抗原决定簇，不同的抗原亦可能有类似的抗原决定簇，因此一种抗血清可能与几种抗原结合。所以同时最好亦用结构相近的抗原做吸收实验，以避免抗原的交叉反应。

（三）替代实验

用制备第一抗体相同种属的正常血清（1/10或相同lgG浓度）替代第一抗体或用第二抗体相同种属的正常血清替代酶标抗体／桥抗体或省略其中任何一种免疫试剂或酶等，以PBS代替之，分别孵育切片，结果均应为阴性。

（四）置换实验

应用无关的特异性抗体代替第一抗体，孵育切片，结果应阴性。如果同时进行几种特异性抗体的ICC染色时，彼此之间即为此类对照。例如，无关的数种抗体，均在相同部位出现类似阳性结果时，非特异性着色的可能性较大，应慎重判断。

（五）阳性对照

不具有ICC染色经验者，从事此项工作时，最好同时染色已知阳性标本，以排除操作过程失误所致的染色阴性。阳性标本最好是冰冻切片。

另外，在观察新的组织抗原时，最好同时比较不同方法固定的组织标本、冰冻切片及石蜡切片的ICC染色，选择最佳条件，以期得到良好的实验结果。

二、假阳性及其处理

组织成分与各种染色试剂及抗血清之间的非特异性结合称假阳性，其主要原因和处理方法如下：

（一）组织细胞内色素

与DAB沉淀物颜色类似的色素，例如黑质内的神经黑色素，不易与反应产物区别开来。可用其它电子供体或免疫荧光技术鉴别之，亦可改用ALP代替HRP，进行染色。

（二）类过氧化物酶活性

RBC内的血红素辅基有类过氧化物酶活性，当组织内存在红细胞时，即使不加过氧化物酶，亦可出现阳性染色。用甲醇-0.3%H2O2孵育标本20分钟（室温），能抑制这种假阳性。甲醇可以使血红素蛋白中的（亚铁）血红素游离，后者被H2O2破坏，从而抑制类过氧化物酶的活性。一般认为，RBC的染色容易同其它组织细胞区别，且动物实验还可通过灌注冲洗组织内的RBC，所以此步往往被省略。

（三）内源性过氧化物酶活性

粒细胞、巨噬细胞等存在内源性过氧化物酶，能够与DAB-H2O2反应，导致假阳性，所以含此类细胞较丰富的脾脏、肝脏、骨髓等组织，ICC染色时，最好做内源性酶阻断。适当的固定、经酸酒精孵育15~20分钟，或1％乙酸–甲醇硝基铁氮化物处理，冰冻切片可用苯肼孵育15~20分钟，均能不同程度地抑制内源性酶的活性。Li（1987）报告，应用0.1%NaN3-0.3%H2O2孵育10~15分钟（室温）能较好地抑制内源性过氧化物酶的活性，冰冻切片效果尤佳。嗜酸性粒细胞内源性过氧化物酶活性较强。上述各种处理后，仍残留部分活性，此种情况，在DAB-H2O2显色中加入终浓度为0.05 NaN3，基本上可达到完全阻断的作用。但是，各种封闭内源性过氧化物酶方法均不同程度地破坏组织的抗原性，所以在不影响反应结果判断或能够同内源性酶的反应所致的假阳性区别时，尽量避免此类处理或改用ALP代替HRP进行ICC染色，也可以在用第一抗体与抗原反应结合后，再进行消除内源酶的处理。

（四）游离醋基

酵类固定的组织切片上，可能存在些游离醛基，后者能与蛋白质（含IgG）间非特异性结合，导致假阳性，用白蛋白或封闭性阻断等预先孵育的切片，可封闭之。

（五）疏水键和离子键

免疫球蛋白可通过疏水键或离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体（冰冻切片Fc受体保存尤佳）非特异性结合。用正常血清（制备第二抗体种属的血清为首选），于第一抗体前孵育切片，可消除之。“4”或“5”重叠应用，更有利于降低背景染色。

（六）天然抗体及不纯抗体

天然抗体是指因动物自然感染等原因血清中存在的部分抗体：不纯抗体是指在制备抗体血清时，所用的抗原不纯，获得的抗体含有杂质抗体。当天然抗体或不纯抗体与组织成分结合时，可引起非特异性染色。上述二者的含量均较低，增加第一抗体的稀释度，可以降低其非特异性染色。

（七）载体蛋白抗体

制备小分子多肤（分子量小于4kD）的抗体时，需借助载体蛋白，使小分子多肤获得免疫原性，刺激动物产生特性抗体。因载体本身具有抗原性，故动物同时也产生抗载体蛋白抗体，与组织蛋白结合后，引起背景染色。用固相吸收技术，能将载体蛋白抗体除去。一般市售抗体，均经特异性检测，所以“6”和“7”可不必考虑。

三、抗体有关事项

（一）血清特异性检测

为了发现新的物质或其它方法未能显示的物质、而又无相应抗体可购买时，往往需要自己制备抗血清。制备时应检测抗血清的特异性。常用的方法有：

1.放射免疫分析（RIA）、免疫扩散或电泳及ICC法

在制备抗血清的过程中，用RIA和免疫电泳等方法检测抗血清的效价是必不可少的。一般认为，RIA和免疫电泳最佳稀释度较高。ICC染色时，应从其1％的稀释度试用之较合适。在制备ICC用抗血清时，最好在应用RIA和免疫电泳法的同时结合ICC染色，以鉴定抗血清的质量（制备单克隆抗体时，仅用ICC染色筛选特异克隆即可）。因为免疫过程中，各个时期抗血清效价是不同的，例如给动物免疫产物，7周时血清ICC染色较好，RIA不佳；在10-12周期间，RIA效价升高，但ICC染色较差。因此制备ICC用抗血清时，应在ICC染色效价最佳时，收集抗血清。

2.系列稀释第一抗体法

在一定稀释度时，抗体的特异性结合最强；继续增加抗体的稀释度，特异性反应将随之减弱至消失。因此采用系列稀释第一抗体的方法，能够验证抗血清的特异性。

（二）抗体的选择

原则上应选择在较高稀释度时染色较佳而背景较低、结果稳定、重复再现性良好的抗体。供ICC研究用的抗体种类繁多，制造商如林，不同的厂家的相同抗体，其价格、包装及抗体的最佳工作浓度，差异较大。所以选购时，应多听取有经验者的建议。

（三）抗体最佳稀释度的检测

抗原抗体反应要求一定比例，过最或不足，均不能达到预期的结果，所以ICC染色时，应进行抗体最佳稀释度的检测。市售抗体所附说明书均标有工作液浓度，但实验上，厂商常常给较低的稀释倍数，因此应用时，可将所给工作液浓度稀释数倍至数百倍再进行系列染色，选择其中特异性染色最强、背景着色最低的稀释度作为ICC染色浓度。在抗体来源不明、又无任何可供参考依据时，则可从原液至数倍稀释试用。另外，酶标抗体／连结抗体和PAP复合物等也需确定最佳工作液浓度。一般认为酶标抗体可用稍高浓度，例如HRP标记抗体为1:100、ALP标记抗体为1:50~100染色较理想。PAP法染色时，连结抗体稀释1:50、PAP复合物用1:50~200染色较合适。

（四）抗体的保存

为确保ICC染色结果稳定、再现性良好，应避免抗体反复冻融所致的效价降低。第一抗体分装、冷冻保存为佳，其最小包装可为每次用量或1周内用量。例如某抗体的工作液浓度1:1000~2000，每次染色需抗体量为1~4毫升时，则所需原液为1~2微升。将原液分装成儿微升难度较大，所以先将原液稀释为1:100，每支离心管内100微升保存，应用前稀释至工作液浓度。后者不宜冰冻，4℃可保存2~3周，原液和1:10~100的抗体在-80℃可保存数年而染色结果不变。单克隆抗体为培养液上清或腹水时，应4℃保存，尽早应用。酶标抗体和PAP复合物原液4℃保存1年左右，免疫活性和酶活性不发生改变，大量制备的酶标抗体IPAP复合物最好分装后于-80℃或-20℃保存。所分装的抗体，应注明名称、稀释度、量及日期等，同时应在笔记本详细记录。ICC研究所用的任何抗体及酶，均应严格记录，妥善管理，才能保证实验成功。

四、单克隆抗体

在单克隆抗体问世前，ICC染色中通常所用的抗血清均为多克隆抗体，即抗血清含有多个B淋巴细胞株所分泌的抗体，这些抗体的性质不完全相同，不同的抗血清之间可能有交叉反应，使ICC染色受到一定限制。近年，单克隆抗体的引入，特别是市售单克隆抗体的种类和数量的迅猛发展，及各实验者比较容易制备自己所需的单克隆抗体，为ICC染色在特殊抗原定位、生物活性检测、肿瘤标记识别中，开辟了更广阔的前景。

单克隆抗体的特点

（1）酶标抗体

自己制备或市售商品的单克隆抗体，绝大部分为小鼠IgG、Kappa型，所以酶标抗体选择抗小鼠IgG的多价抗体，进行ICC染色比较稳妥。

（2）特异性

专一性强：单克隆抗体是由同一细胞株分泌的，性质均一，且有相同的亲和力，识别同一抗原决定簇。这在研究某些类似物质的局部定位、分型、生物活性检测及肿瘤诊断等方面有重要意义。但同时也应注意，不同抗原的相同抗原决定簇有被识别的可能，所以应结合其它方法，判断其结果。

（3）不需纯化抗原

多克隆抗血清在制备时，要求抗原相当纯。而制备单克隆抗体时，不需纯化抗原。一些不能纯化的组织（游离）细胞可直接免疫，经克隆化，筛选所需细胞株，避免了纯化抗原的麻烦，这在研究人类各种疾病等有重要价值。

（4）工作液浓度

不同的单克隆抗体效价各异，所以ICC染色时需检测最佳稀释倍数，大量培养纯化的抗体可用更高的稀释倍数。

（5）切片选择

单克隆抗体仅识别抗原物质的某一抗原决定簇，所以以新鲜组织的冰冻切片为首选。因为在固定过程中，可能使抗原物质发生某些改变，致使其与单克隆抗体反应的抗原决定簇丢失，故拟用石蜡切片，可固定组织冰冻切片。ICC染色时，在制备单克隆抗体过程中，应该用同样标本和方法筛选所需细胞株，才能确保染色成功。

（6）特异性检测

单克隆抗体的特异性强，性质均一，没有必要进行RIA分析和吸收实验等。自己制备的单克隆抗体，其特异性检测最佳方法为相同组织提取物质进行免疫电泳，确定抗原的分子量等。

（7）发现新物质

在制备肿瘤或其它组织细胞单克隆抗体时，往往有各种各样的抗原特异性杂交瘤细胞株产生，在筛选过程中，能够发现一些新的杂交瘤株，经培养制备相应的抗体，用于一些新领域的研究。

四、增加染色强度方法

通常染色、着色较弱时，应想办法改进标本的处理和抗原的保存，提高抗体的穿透力，再重新染色。但有时组织本身抗原含量较少或标本难得（如手术材料），可尝试下述方法以提高染色强度，确保染色成功。

（一）重复显色

一般认为，对ALP标记抗体，延长显色时间其反应可增强。但在同一染色液中延长显色时间，往往容易产生沉淀，出现终产物弥散现象。所以重新配制显色液继续呈色，第二次显色时间可缩短至4~5分钟，能提高部分染色强度。

HRP标记时，重复呈色无明显增强效应。通常有显色液中加入0.0lmol/Llmidazole或改用酸性缓冲液（pH5.5~6.0），可提高染色强度；亦可在DAB反应后，1%OsO4浸泡固定5~15分钟，继之0.4％亚铁氰化钾／0.1NHCl液处理5分钟，DAB终产物呈黑色，与背景的对比度较佳。另外，在间接法显色较弱时，亦可试用PAP法、ABC法等，探索较合适的染色方法。

（二）重复第一抗体

在漂洗过程中，结合力弱的抗体易离解丢失，重复应用第一抗体有利于抗体与组织抗原结合，增加抗体数量，提高染色强度（Noorden 1983）。切片经第一抗体孵育后，漂洗，再孵育第一抗体（此时第一抗体可稀释较原工作浓度1倍）1～2小时，然后经酶标抗体孵育，呈色观察同前。所用抗体为多克隆血清时，提高第一抗体的稀释度，重复孵育2~3次，可得到一定效果。单克隆抗体，经第一抗体→酶标抗体→第一抗体→酶标抗体，也能增加染色强度。

（三）双桥PAP法

基本操作与单桥法相似，所不同的是切片经单桥PAP复合物孵育后，漂洗，再孵育桥抗体和PAP（Vacca
1982）复合物（均可稀释1倍），即切片经两次桥抗体、两次PAP孵育——双桥法（double bridged technique）。据报告，第一抗体用较高稀释度，也能获得与双桥法相近的染色效果。理论上讲，双桥法是ICC染色中较为敏感的方法，它较单桥法灵敏20~50倍，能够增加抗原的显示数量（25%）和反应终产物的大小。这在研究胚胎发育过程中一些抗原含量较低的组织时，具有一定的应用价值。双桥法可能是通过下列途径提高其敏感性的：①重复的桥抗体与PAP复合物中的抗HRP抗体的未饱和抗原位置结合，再连结另外的PAP复合物，在抗原部位，抗体间彼此结合形成较大的抗原抗体复合物，具有多个酶分子，使反应增强。这可能是双桥法敏感性增高的主要机制；②重复的桥抗体与第一抗体未饱和的抗原位置结合，使第一抗体上结合较多的桥抗体及PAP复合物。但PAP复合物较大，应设法提高其穿透性，达到增加染色强度的目的。

（四）半抗原夹层法

半抗原夹层法（hapten sandwich method）是首先用半抗原（FITC等）标记的第一抗体与组织抗原结合，继之用HRP（或ALP）标记的抗FITC抗体与组织抗原结合的FITC的反应，呈色后观察抗原存在部位。FITC为一种荧光色素，荧光显微镜下呈亮绿色荧光，所以也可以同时观察免疫荧光染色结果。FITC特异荧光褪色后，其抗原性仍不丢失，从这种角度讲，荧光抗体法的切片亦能半永久保存。该法较一般间接法敏感性高，最大优点是不管第一抗体来自何种属，只要与FITC连结，均可被同一酶标记的抗FITC抗体识别，避免了准备不同种属的酶标抗体的麻烦，而且FITC标记抗体技术成熟、稳定，商品种类多，容易购买。