——研究背景——
由蛋白质、核酸等生物大分子通过液–液相分离（LLPS）形成的无膜细胞器广泛参与细胞多种关键生命活动。蛋白质发生相分离通常依赖于分子之间形成的多价相互作用，而无序蛋白（IDPs）或蛋白质无序区域（IDRs）被认为在其中发挥了重要作用。线性多价蛋白是相分离蛋白中重要的一类，其结构通常由无序链（IDR linker）串联多个模块化结构域构成。以往的研究多聚焦于模块化结构域如何驱动相分离，而连接这些结构域的无序链的功能则常被忽视。
近日，北京大学来鲁华教授团队在《Cell Reports Physical Science》上发表了题为“Protein IDR linkers regulate overall protein conformation and phase separation”的研究论文，揭示了多价相分离蛋白中的无序链并非简单的 “连接纽带”，而是通过自身序列特征调控蛋白质整体构象，进而精准调制相分离行为和凝聚体物理特性的 “隐形调控者”。研究发现，无序链中氨基酸残基簇的尺寸和种类通过影响分子内相互作用的强弱来改变蛋白构象，调控模块化结构域的有效浓度，从而调控相分离。
——主要内容——
// 体外相分离研究体系的选择与构建//
研究团队以B3家族转录因子VERNALIZATION1 (VRN1)为模型，探究其无序链序列特征如何调控蛋白与DNA的液–液相分离。线性多价蛋白VRN1包含两个结合DNA的B3结构域及中间的无序连接链（图1A），通过B3结构域与DNA的多价相互作用发生相分离。研究团队首先通过序列分析系统提取了植物B3家族转录因子中IDR linker的序列特征，发现这些IDR linker富含带电和芳香族残基，进一步分析发现，这些氨基酸可以形成静电相互作用和阳离子-π相互作用模块，且linker的序列越长，相互作用模块出现的概率越高（图1）。粗粒化分子动力学模拟表明，较长的linker（>200个残基）其末端距显著小于Flory理论预测值，呈现出更紧凑的构象（图1E）。
图1. 类VRN1结构的B3家族蛋白IDR linker序列分析。(A) VRN1结构示意；(B) B3家族IDR linker序列分析流程；(C) B3家族无序链与植物蛋白质组无序链芳香残基、带电残基的比例；(D) linker含有阳离子-π斑块、电荷斑块或两者同时含有的蛋白质数目及其无序链长度分布；(E) CALVADOS2模拟分析B3族无序链的Ree值和参考Ree值；（F-I）长度分别大于50、100和200个残基的无序链含有相互作用斑块的比例。
为验证无序链中特征序列对相分离的影响，研究团队参照VRN1及B3家族的静电和阳离子–π特征序列，在中性链突变体VRN1-PSN160的基础上构建了两组突变体：①静电突变体，在中性无序链两端插入不同尺寸的源自野生型VRN1的带电簇；②阳离子–π突变体，在同一位置插入源自FUS蛋白的“SYGQ”和“RGG”斑块以引入阳离子-π相互作用（图2）。
图2. VRN1静电和阳离子–π系列突变体的序列设计。
//无序链序列特征影响相分离能力//
接着，研究团队在体外测定了两个系列突变体与DNA的相分离能力。浊度测定和共聚焦显微镜观察表明，无序链长度为160 AA时，正负电荷斑块需包含至少四个带电残基（如PS160-4AB和PS160-7AB）才能有效形成相分离凝聚体，而较小电荷斑块（PSN160、PS160-2AB）则无法引发相分离（图3）。双色荧光交相关光谱（dcFCCS）实验进一步证实，较大电荷模块能显著降低相分离早期VRN1与DNA形成复合物的阈值浓度，促进纳米尺度凝聚体的形成（图3）。
同时，研究还发现无序链中的阳离子-π相互作用序列（SYGQ、RGG序列）也能促进相分离，且作用强度随序列重复次数增加而增强（图4）。这些结果表明，无序链中的静电和阳离子-π相互作用序列可以促进VRN1与DNA相分离。
图3. VRN1静电系列突变体的体外相分离。(A) 浊度实验；(B) 共聚焦荧光显微镜实验；(C) dcFCCS实验流程示意图；(D) dcFCCS实验中分别标记荧光标签的DNA和VRN1的荧光自相关曲线，及交相关曲线。
图4. VRN1阳离子–π系列突变体的体外相分离。
为阐明静电与阳离子-π相互作用调控VRN1相分离的机制，研究分析了VRN1突变体的构象与DNA结合特性。动态光散射（DLS）显示，增大IDR中电荷模块或阳离子-π序列尺寸可使蛋白构象更紧凑（图5A）。这表明特征序列促进了分子内相互作用。荧光偏振（FP）实验进一步表明，相比于中性链突变体，特征序列尺寸更大的突变体与DNA的亲和力显著增强，PS160-7AB与PS160-RGG4表观解离常数Kapp从约120 nM降至约40 nM（图5B，5C）。综上，这些结果表明无序链序列通过分子内相互作用调控VRN1构象与B3结构域的局部浓度，影响其多价相互作用及相分离行为。
图5. (A) DLS表征VRN1的平均水合直径；(B)&(C) FP实验表征VRN1突变体与DNA的表观亲和力。
//无序链序列特征影响相分离凝聚物性质//
为了探究两种特征序列的不同，研究团队对两类突变体所形成凝聚物的性质进行了探究。研究通过荧光漂白恢复（FRAP）和荧光相关光谱（FCS）等技术，比较了由静电和阳离子-π突变体所形成相分离凝聚体的流动性。结果表明，尽管两种相互作用均能促进相分离，但所形成的凝聚体流动性存在显著差异。静电突变体形成的液滴荧光恢复快、恢复程度高，流动性好；而阳离子-π突变体形成的液滴恢复慢且不完全，内部粘度更高，流动性差。（图5）
图6. (A) FRAP实验表征PS160-7AB和PS160-RGG4的流动性差异；(B), (C)和(D) 使用共聚焦显微镜联合FCS实验检测不同突变体凝聚物液滴内外黏度差异。
进一步研究发现，这种差异源于两种IDR本身构象的不同。动态光散射和粗粒化分子动力学模拟均表明，具有阳离子-π序列的IDR倾向于采取更紧凑的构象（图7B，7C）。这种紧凑的构象导致其与DNA形成的凝聚体内部分子浓度更高，从而降低了其流动性（图7D）。综上所述，IDR中的相互作用类型不仅影响相分离能力，还影响凝聚体的物理状态，阳离子-π相互作用倾向于促进高密度、低流动性的凝聚体的形成。
图7. (A) 三个VRN1突变体的无序链序列；(B) DLS实验表征不同盐浓度条件下IDR的水合直径；(C) 粗粒化模拟计算的IDR末端距；(D) 共聚焦显微镜实验检测液滴内部的DNA浓度。
——总结——
该研究利用VRN1-DNA模型系统，探讨了IDR序列特征如何调控相分离。研究发现，IDR链内特征序列（如静电与阳离子-π相互作用）的尺寸可以调控蛋白构象，调控B3结构域的有效浓度，从而有效降低相分离的阈值浓度。此外，相比于静电系列突变体，阳离子-π突变体构象紧凑，导致形成的凝聚体内部分子浓度更高、粘度更大、流动性显著降低。相分离凝聚物的流动性与功能直接相关，因此，细胞可能通过选择特定的氨基酸类型，实现功能的特异性。该研究为理解细胞如何通过IDR的序列特征精细调控无膜细胞器的形成及其物理化学性质以适应特定生理功能提供了新的机制见解。
图8. 无序链序列特征通过蛋白构象调控相分离能力及凝聚物性质。
北京大学化学与分子工程学院来鲁华教授为该论文的通讯作者。北京大学化学与分子工程学院博士生杨钰婕，北京大学前沿交叉学科研究院北大–清华生命科学联合中心博士生穆俊羲为该论文的共同第一作者。中科奥辉郑敦锦工程师为该研究提供了测试帮助。该研究得到了国家自然科学基金和国家重点研发计划的支持。
论文链接：
Yang, Yujie, et al. “Protein IDR Linkers Regulate Overall Protein Conformation and Phase Separation.” Cell Reports Physical Science (2025): 102964. Print. https:///10.1016/j.xcrp.2025.102964