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MCAM 在 EGFR-TKI 耐药肺腺癌细胞中表达较为高
首先，基于 HCC827 和高通量膜蛋白芯片阵列中的 HCC827GR 细胞[9]和 GEO 公开数据库（的先前数据，MCAM 表达在多个 EGFR-TKI 耐药细胞系中有所增加（见图 1A， B;无花果。 第一季 A-B）。作者还通过 ELISA 检测到分泌 MCAM（sMCAM）的表达。sMCAM 在 HCC827GR 和 HCC827OR 细胞中的表达明显高于 HCC827 细胞（见图 1C）。根据 qRT-PCR、西方印迹和免疫荧光染色（见图 1D-F），HCC827 EGFR-TKI 耐药细胞的 MCAMmRNA 和蛋白表达水平显著高于 EGFR-TKI 敏感细胞。
MCAM 在 EGFR-TKI 耐药肺腺癌细胞中表达较高。（A）热图显示了 HCC827 和 HCC827GR 可溶受体阵列芯片中的 MCAM 表达水平。（b）利用 GSE193258 数据集评估了 HCC2935、HCC827、H1975 和 PC9 奥西替尼耐药细胞中的 MCAM 表达。（C）通过 ELISA 在 HCC827GR 和 HCC827OR 细胞中确认了分泌 MCAM（sOPN）的表达。（D-E）HCC827、HCC827GR 和 HCC827OR 细胞中 MCAM 的表达水平通过 qRT-PCR（D）和西方墨迹（E）评估。（F）采用免疫荧光染色检测 MCAM 表达水平。（G-H）进行了西方印迹分析，以评估在不同时间或不同浓度下处理的 HCC827 细胞中 MCAM 的表达。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001
对 HCC827 细胞进行培养，并暴露于 0.05 μmol/L 的吉非替尼或奥斯默替尼，以研究肺腺癌细胞中 MCAM 表达可能的继发性增加。qRT-PCR 和西方墨迹法用于检测不同时间点 MCAM 的表达水平。随着 EGFR-TKI 治疗时间的增加，MCAM 表达也随之增加，且通过 Gefitinib 和 osimertinib 的浓度梯度结果也证实了这一结果（见图）。1G-H;无花果。第一季C-F）。
MCAM 介导的 EGFR-TKI 在体外肺腺癌癌细胞中的作用
采用 CCK-8 细胞毒性分析法，在体外检测 MCAM 干扰对 HCC827GR 细胞和 HCC827OR 细胞中 EGFR-TKI 耐药性的影响。MCAM 击倒后（见图）阿拉伯数字A-B）、HCC827GR 和 HCC827OR 细胞分别用不同浓度的吉非替尼和奥斯默替尼处理，并计算了半最大抑制浓度（IC50）。结果显示，在 EGFR-TKI 耐药肺腺癌细胞中，MCAM 敲低后，Gefitinib 或 osimertinib 的 IC50 降低（见图 2C-D），表明对 EGFR-TKIs 的敏感性在一定程度上恢复。在用吉非替尼或奥西马替尼 IC50 治疗后，HCC827 细胞中的异位 MCAM 表达进行了进一步研究，以进一步澄清 MCAM 是否参与肺腺癌细胞获得性耐药性。这些结果表明，MCAM 的过度表达显著增加了敏感细胞对吉非替尼或奥斯默替尼的耐药性（见图）。第二季A-C）。
MCAM 介导肺腺癌细胞体外的 EGFR-TKI 耐药性。通过（A-B）qRT-PCR 和西方印迹法检测转染后 HCC827GR 和 HCC827OR 细胞中 MCAM 的表达。（C）通过 CCK-8 检测测定了用 si-MCAM 或 si-NC 转染的 HCC827GR 细胞对吉非替尼的敏感性。（D）通过 CCK-8 检测测定了用 si-MCAM 或 si-NC 转染的 HCC827OR 细胞对奥默替尼的敏感性。**P < 0.01;P < 0.001
MCAM 过表达在体内诱导肿瘤对 EGFR-TKIs 的耐药性
上述实验证实 MCAM 参与了肺腺癌细胞体外对 EGFR-TKIs 的耐药性。四周大的 BALB/c 裸鼠被随机分为载体组和 MCAM 过表达组，每组 15 只裸体小鼠，以进一步验证 MCAM 在体内的作用。裸小鼠被皮下接种载体或 MCAM 过表达细胞，观察肿瘤形成，肿瘤体积每隔一天测量一次。当肿瘤体积达到约 100 mm3 时，载体和 MCAM 过度表达组被随机分为溶剂对照组、吉非替尼组和奥斯默替尼组。药物通过每日胃囊填充（图 3A），每隔一天测量肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。在对裸体小鼠组进行治疗和安乐死后，肿瘤被切除、拍照并称重（图 3B）。如肿瘤生长曲线（图 3C）和肿瘤重量图（图 3D）所示，MCAM 过度表达组的肿瘤体积和重量显著高于对照组，且对照组在接受吉非替尼或奥斯替尼治疗后肿瘤体积和体重显著降低。 表明肿瘤对吉非替尼或奥西替尼治疗有反应。MCAM 过度表达组的治疗敏感性远低于对照组。此外，Ki-67 免疫组织化染色显示，吉非替尼和奥斯马替尼在 MCAM 过度表达组抑制肿瘤细胞增殖方面效果不如对照组（图 3E）。 此外，持续的 EGFR-TKI 治疗还能诱导肿瘤中 MCAM 表达的上调（见图 3F-G）。
MCAM 过表达在体内诱导肿瘤对 EGFR-TKIs 的抗性。（A）动物实验的示意图。（B-D）用吉非替尼和奥西替尼（B-C）治疗的 HCC827 MCAM-CDX 肿瘤和 HCC827 载体 CDX 肿瘤的生长，以及肿瘤重量（D）的变化。携带 CDX 的小鼠（ 每组 n = 5 只）通过口服加维法治疗载体（1%碳甲基纤维素 1%钠）、盖非替尼（5 mg/kg，每日一次）或奥西替尼（2 mg/kg，每日一次）进行口服加维治疗。（E）用于细胞增殖的原位分析，对 Ki-67 进行 IHC 染色。Ki-67 是一种细胞增殖标记。（F-G）通过西方印迹法检测了吉非替尼和奥斯默替尼治疗对 HCC827-CDX 肿瘤中 MCAM 表达的影响。每组随机抽取三个肿瘤样本。比例杆 = 200 微米，***P < 0.001
本研究通过人体 RTK 磷酸化阵列分析了 si-NC 组和 si-MCAM 干扰组的 HCC827GR 细胞，以及载体组和 MCAM 过表达组的 HCC827 细胞。结果显示，Janus 酪氨酸激酶 3（JAK3）磷酸化水平在 MCAM 敲低后下降，但在 MCAM 过度表达后增加，表明 MCAM 通过激活 JAK3 信号通路发挥作用（见图）。4A-B）。随后，进行了西方印迹法检测对照组和 MCAM 过表达组 JAK3 磷酸化水平的变化，并检测到 JAK3 下游的 AKT 磷酸化水平。结果显示，在 MCAM 过度表达组中，JAK3/AKT 磷酸化水平显著上升。相反，当 MCAM 被敲低时，磷酸化的 JAK3 水平降低，磷酸化的 AKT 水平下降（见图 4C-E），进一步证实 MCAM 能够激活 JAK3 信号通路。
MCAM 激活了肺腺癌中的 JAK3 信号通路。（A）使用 RTK 阵列识别了在 MCAM 干扰下 HCC827GR 细胞表达下调的蛋白质，以及在 HCC827 细胞中表达上调的蛋白。（B-C）采用西部印迹法检测 HCC827GR（B）和 HCC827OR（C）敲低基及 NC 基的 JAK3 及下游 AKT 磷酸化水平。D，西方印迹法用于检测 HCC827-overexpressingMCAM 组和载体组中 JAK3 和 AKT 磷酸化水平的变化
MCAM 通过与整合素β1 相互作用激活 JAK3，促进细胞耐药性
基于上述结果，作者使用 STRING 数据库预测可能与 MCAM 蛋白相互作用的蛋白质，以确定 MCAM 如何影响 JAK3 信号通路（图 5A）。MCAM 和整合素β1 形成复合物，导致三阴性乳腺癌的放射电阻[10]。免疫沉淀结合质谱（IP/MS）技术用于鉴定 MCAM 过度表达 HCC827 细胞中 MCAM 的潜在共受体。IP/MS 揭示了 MCAM 相互作用中涉及的蛋白质网络，涵盖整合素α6 和整合素α4，均属于整合素家族。随后，作者将抗药菌株的质谱结果整合，观察到这些菌株中只有 a6 表现出升高水平（见图）。第二季此外，已证明整合素α6 与整合素β1 形成复合物[11]，作者发现 MCAM 与整合素β1 之间存在正相关（见图。第二季E-F）。随后在对接模拟中使用了 ZDOCK两种结构，分子对接结果表明 MCAM 可以与 Integrin β1 相互作用（见图 5B）。生存分析结果表明，MCAM 和整合素β1 的高表达水平与较低的整体生存率相关（图 5C）。随后进行了共免疫沉淀实验以验证 MCAM 与整合蛋白β1 的相互作用，结果显示 MCAM 和整合素β1 相互作用（图 5D）。免疫荧光实验显示，在 HCC827GR 和 HCC827OR 细胞中，MCAM 和整合素β1 均位于细胞膜内并共定位（见图）。 5E）。此外，Western blot 分析证实，MCAM 的过度表达增加了 Integrin β1 的表达，而 MCAM 的敲低则降低了 Integrin β1 的表达（见图 5F， H;无花果。第二季G），通过免疫荧光染色得到确认（见图 5G;无花果。第二季这些结果表明 MCAM 可能通过整合素β1 激活 JAK3。随后，作者将整合素β1 siRNA 转染到 MCAM 过表达和对照细胞中。Western 印迹结果显示，MCAM 过表达会增加整合素β1 和 p-JAK3 蛋白的表达。在 MCAM 过表达细胞系中敲低整合素β1，降低了异常激活的整合素β1 和 p-JAK3 蛋白的表达（见图 6E）。CCK-8 细胞毒性检测还显示，降低整合素β1 表达可部分挽救 MCAM 过度表达引起的 EGFR-TKI 抗药性（见图 6C-D）。
MCAM 与整合素β1 相互作用。（A）通过 STRING 数据库预测了 MCAM 相互作用蛋白。（B）通过 ZDOCK 网站预测了 MCAM 与整合蛋白β1 之间的分子动力学和分子结合。（C）生存分析显示，MCAM 和整合素β1 的表达状态显示存活率存在差异。（D）通过 coimmunoprecipitation.（E）通过免疫荧光检测 MCAM 与整合蛋白β1 共定位，检测了 MCAM 与整合蛋白β1 的相互作用。（F）通过敲低 MCAM 后通过西方印迹法检测到整合素β1 表达。（G）通过 MCAM 敲低后免疫荧光染色检测到 HCC827OR 细胞中的整合蛋白β1 表达。（H）使用西部印迹法检测 MCAM 过度表达后整合素β1 的表达。比例杆 = 10 微米
MCAM 通过与整合素β1 的相互作用激活 JAK3，促进细胞耐药性。（A）通过 CCK-8 检测法确定了伊马匹抗处理的 HCC827GR 细胞对吉非替尼的敏感性。伊马匹利单抗是一种针对 MCAM 的人源化单克隆抗体。（b）通过 CCK-8 检测确定了伊马匹抗处理的 HCC827OR 细胞对奥默替尼的敏感性。（C-D） 敲低整合素β1 可抑制 MCAM 引起的细胞耐药性。（E）敲低整合素β1 抑制 MCAM 诱导的 HCC827 细胞中 JAK3 信号通路的激活。（ 女 ）用奥西替尼和托法替尼处理 HCC827OR 细胞 72 小时后，再用 CCK8 检测确定细胞存活能力。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001
本研究引入了 MCAM 单克隆抗体，以进一步验证 MCAM 在介导药物耐药性中的作用。通过 CCK-8 细胞毒性分析，作者观察到当吉非替尼或奥斯默替尼与伊马匹利单抗联合使用时，耐药细胞的 IC50 降低（见图）。6A-B）。此外，本研究还考察了 JAK3 抑制剂托法替尼与奥西替尼联合使用时耐药性的变化。研究结果表明，JAK3 抑制剂与奥斯默替尼联合使用显著逆转了细胞对奥斯替尼的耐药性，且 JAK3 抑制剂浓度越高，协同效应更为明显（见图）。6 总之，MCAM 通过与整合素β1 相互作用并激活 JAK3 信号通路，诱导了肺腺癌中的 EGFR-TKI 耐药性。
根据上述结果，EGFR-TKI 抗药细胞系的 mRNA 水平相较于 EGFR-TKI 敏感细胞系有所增加。因此，作者在这里探讨了 MCAM 表达增加的原因。使用 hTF 靶向转录因子数据库 GTRD预测调控 MCAM 表达的转录因子。此外，根据 GEO 数据库（GSE193258），排除了 EGFR-TKI 耐药细胞系表达未显著增加的基因，并获得了 6 种替代转录因子：RORA、FOXO4、STAT2、BACH2、MEIS3 和 ETV7（见图）。第三季答）上述 RTK 结果表明 JAK3 信号通路被激活，且 JAK/STAT 信号通路被视为细胞功能中的核心通信节点之一，作者考察了信号引导和转录激活因子 2（STAT2）在 EGFR-TKI 耐药肺腺癌中是否次级表达增加。STAT2 的 mRNA 和蛋白质水平显著高于敏感肺腺癌细胞（图 7A-B）。在接受不同浓度的吉非替尼和奥斯默替尼治疗后，作者观察到 STAT2 和 p-STAT2 的表达水平逐渐上升。此外，核质解离结果显示细胞质和细胞核中 p-STAT2 水平均有所增加（图。第三季B-D）。随后对 HCC827 细胞转染了 STAT2 过表达质粒，结果显示 STAT2 过表达后，MCAM 的 mRNA 和蛋白表达水平显著上升（见图）。 7C-D）。qRT 的 PCR 和 Western 印迹结果显示，STAT2 的敲低导致 MCAM 表达下调（见图 7E&H）。这些结果表明 STAT2 通过转录调控 MCAM 基因表达。随后，作者使用 JASPAR 数据库预测 STAT2 在 MCAM 启动子区域的潜在结合位点，并将包含野生型 MCAM 结合位点和突变结合位点的构造体插入重组质粒中（图 7I）。在对 293T 细胞与 STAT2 的过表达质粒和 MCAM 的野生型质粒共转后，作者观察到荧光素酶报告基因活性显著提升。然而，当结合位点突变且 STAT2 过度表达时，突变 MCAM 质粒的荧光素酶活性未显著变化（见图 7J）。这些发现表明 MCAM 是 STAT2 的靶基因。
STAT2 诱导 MCAM 转录。进行了（A-B）qRT-PCR 和西方印迹法，检测 HCC827、HCC827GR 和 HCC827OR 细胞中的 STAT2 表达水平。（C-D）在 HCC827 细胞中 STAT2 过表达后，进行了 qRT-PCR（C）和西方印迹（D）检测 MCAM 表达水平。（E-F）在干扰 HCC827OR 细胞中的 STAT2 后，通过 qRT-PCR（E）和西方印迹（F）测定了 MCAM 表达水平。（G-H）在 HCC827GR 细胞中干扰 STAT2 后，通过 qRT-PCR（G）和西方印迹（H）测定 MCAM 表达水平。（ 一 ）MCAM 野生型和突变质粒的设计。（J）使用双重荧光素酶分析法评估荧光素酶活性的变化。**P < 0.01;P < 0.001
总结
作者发现 MCAM 表达在 EGFR-TKI 耐药肺腺癌中有所增加，并参与 EGFR-TKI 耐药的过程。从机制上看，MCAM 可与整合素β1 结合形成复合物，从而激活 JAK3 蛋白及下游 AKT 途径促进细胞增殖，从而在敏感细胞系中获得 EGFR-TKI 耐药性，MCAM 则由转录因子 STAT2 调控。值得注意的是，MCAM 以可溶性蛋白形式分泌，使其能够在患者血清中检测，并在预测 EGFR-TKI 靶向治疗反应方面具有潜在临床价值。此外，针对 MCAM 的小分子抑制剂或单克隆抗体可能代表克服 EGFR-TKI 耐药性的新型治疗策略。作者的体外实验表明，JAK3 抑制剂与奥斯默替尼的联合使用可以提升治疗敏感性。尽管如此，仍需进一步的体内研究和临床试验以确认这些发现并评估其在临床实践中的可行性。总之，本研究为对 EGFR-TKI 产生耐药的患者提出了一种有前景的新治疗方法。
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