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合并数据集中的批处理效应，即 CCA_merge_data（集成GSE107943 和 TCGA）和 IBD_merge_data（集成 GSE16879、GSE112366 和 GSE75215），通过“sva”包被去除。归一化通过“limma”包（ 图 1A–H）进行。
CCA 和 IBD 的数据预处理。（A–D）PCA 图显示 CCA 数据集中 GSE107943 和 TCGA 中（A–C）和（B–D）批次效应校正前后的表达模式。（E–H）PCA 绘制了 IBD 数据集中 GSE16879、GSE112366 和 GSE75215 的表达模式，涵盖批次效应校正前后（E–G）和之后（F–H）。
IBD 数据集共获得 209 个 DEGs，包括 162 个上调基因和 47 个下调基因（见图 2A）。还生成了该数据集中前 20 个显著上调和下调基因的热图（见图 2B）。与此同时，CCA 数据集共收集了 10,968 个 DEGs，其中包括 6,077 个上调基因和 4,891 个下调基因（见图 2C）。还生成了该数据集中前 20 个显著上调和下调基因的热图（见图 2D）。此外，IBD 和 CCA 数据集中识别了 50 个交集的 DEGs，涵盖 34 个上调基因和 16 个下调基因（见图 2E 和 F）。
火山图、热力图和共表达的 DEGs。（A）IBD 数据集中 DEGs 的火山图。（B）IBD 数据集中 DEGs 的热力图。（C）CCA 数据集中 DEGs 的火山图。（D）CCA 数据集中 DEGs 的热力图。（E）IBD 和 CCA 数据集共享的共上调 DEG 的维恩图。（F）IBD 和 CCA 数据集共享的共下调 DEG 的维恩图。红色表示上调基因，蓝色表示下调基因，灰色表示非 DEG 基因。WGCNA 在 IBD 和 CCA 中的表现
WGCNA 在 IBD 和 CCA 数据集上同时进行，以考察临床性状与基因表达之间的关系。在这两个数据集中均未发现显著异常样本。根据 WGCNA 算法，IBD 数据集的最佳软阈值功率为 21，CCA 数据集为 7（见图 3A 和 B）。基于模块相似性，IBD 数据集中识别出四个模块，CCA 数据集中识别出 5 个模块（图 3C 和 D）。随后进行了模块-性状相关分析。在 IBD 数据集中，灰色模块与 IBD 呈正相关性最高（r = 0.11， p < 0.05），而 CCA 数据集中，蓝色模块与 CCA 呈最高正相关性（r = 0.89， p < 0.05）（见图 3E 和 F）。最终，通过与关键 WGCNA 模块的 DEG 交叉，获得了 13 个交集基因。这些基因可能参与 IBD 和 CCA 的发病机制（见图 3G）。
WGCNA 识别了 IBD 和 CCA 的关键基因模块，以及 DEGs 与这些关键模块在两种疾病中的交集。（A–B）在 IBD （A）和 CCA （B）数据集中选择最优软阈值能力。（C–D）IBD （C）和 CCA （D）数据集中的基因簇树及模块特征基因的相关分析。（E–F）热图展示了模块特征基因与 IBD 及 CCA 临床性状之间的相关性。红色表示正相关，蓝色表示负相关。（G）来自 IBD 数据集中的 DEG 与蓝色模块，以及 CCA 数据集中 DEG 与灰色模块之间交集基因的维恩图。通过机器学习识别和验证共享枢纽基因
基于机器学习算法进行特征选择，以进一步发现最具诊断意义的基因。在 13 个候选基因中，LASSO 回归选出 8 个基因（见图 4A 和 B），SVM-RFE 识别出 10 个基因（见图 4C 和 D），LR 选出 p3C 为 0.05 的基因（见图 4E）。RF 按重要性评分对前 30 个基因进行了排名（见图 4F 和 G）。最终，识别出八种常见的诊断生物标志物：CCL11、CCL20、DUOX2、DUOXA2、LCN2、NOS2、PDZK1IP1 和 TRIM40（见图 4H）。
识别 IBD 和 CCA 中常见的枢纽基因。（A–B）LASSO 回归分析结果。（C–D）SVM-RFE 结果。（E）逻辑推理分析结果。（F–G）射频分析结果。（H）维恩图，展示了由四种机器学习算法识别的交集基因。
此外，利用 ROC 曲线（ 图 5）评估不同数据集中枢基因的诊断价值（ 图 5A 和图 B）。在 IBD 数据集中，曲线下的区域（AUC）如下：CCL11（0.68）、CCL20（0.61）、DUOX2（0.74）、DUOXA2（0.75）、LCN2（0.71）、NOS2（0.72）、PDZK1IP1（0.64）和 TRIM40（0.66）（ 见图 5A）。在 CCA 数据集中，对应的 AUC 为：CCL11（0.70）、CCL20（0.85）、DUOX2（0.78）、DUOXA2（0.74）、LCN2（0.79）、NOS2（0.64）、PDZK1IP1（0.93）和 TRIM40（0.74）（ 见图 5B）。其中，LCN2、DUOX2 和 DUOXA2 的 AUCs 均大于 0.7。箱形图显示，这三种诊断生物标志物在 IBD 和 CCA 训练队列中的疾病组中显著上调（ 见图 5C–D），表明它们作为 IBD 和 CCA 的生物标志物具有强有力的诊断潜力。
训练数据集中八种常见诊断生物标志物的 ROC 曲线和表达。（A）IBD GSE193677 队列中八种常见诊断生物标志物的 ROC 曲线。（B）CCA_merge_data 队列中八种常见诊断生物标志物的 ROC 曲线。（C）IBD GSE193677 队列中八个常见诊断生物标志物的表达。（D）CCA_merge_data 队列中八种常见诊断生物标志物的表达。
注：*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.0001。
在 IBD 验证数据集中，识别出DUOX2（AUC = 0.88）、DUOXA2（AUC = 0.87）和 LCN2（AUC = 0.90）（ 见图 6A）。在 CCA 验证队列（GSE32879）中，对应的 AUC 为 DUOX2 0.88，DUOXA2 0.63，LCN2 0.88（ 见图 6B）。 其中，DUOX2 和 LCN2 的 AUC 大于 0.8，而 DUOXA2 的 AUC 低于 0.7（ 见图 6B）。箱型图显示 ，DUOXA2 和 LCN2 在疾病组中的表达模式与训练组观察到的一致。然而，DUOXA2 在 CCA 验证队列中并未显示显著差异（ 见图 6C 和 D）。
验证数据集中八种常见诊断生物标志物的 ROC 曲线及表达。（A） IBD_merge_data 队列中八个常见诊断生物标志物的 ROC 曲线。（B）CCA-GSE32879 队列中八个常见诊断生物标志物的 ROC 曲线。（C）IBD_merge_data 队列中八个常见诊断生物标志物的表达。（D）CCA-GSE32879 队列中八个常见诊断生物标志物的表达。
注：**p < 0.01;p < 0.0001。单基因 GSEA
在确定DUOX2 和 LCN2 作为潜在诊断生物标志物后，作者进行了单基因基因富集分析（GSEA），以探索它们的潜在生物学功能。如图 7 所示，富集通路根据与每个目标基因的相关性按递减顺序排序。基因本体论（GO）分析显示，DUOX2 在免疫效应过程、适应性免疫反应以及 B 细胞/淋巴细胞介导免疫方面显著富集。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，DUOX2 主要富集于 TNF 信号通路、IL-17 信号通路以及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路等（见图 7A–D）。
对炎症性肠病（IBD）和 CCA 中共同驱动基因DUOX2 的功能及途径富集分析。（A） DUOX2 的 Go 分析。（C） DUOX2 的 KEGG 分析。（B–D）DUOX2 的 GSEA。
去细胞移植分析显示，LCN2 在适应性免疫反应中显著富集，尤其是与 B 细胞和免疫球蛋白相关的反应。这些包括免疫效应过程、适应性免疫以及 B 细胞/淋巴细胞介导的免疫。KEGG 通路分析发现了 LCN2 在 TNF 和 IL-17 信号通路中的富集、细胞因子-细胞因子受体相互作用、自身免疫和代谢疾病，以及感染和宿主防御通路（ 见图 8A–D）。
LCN2 的功能及途径富集分析，LCN2 是 IBD 和 CCA 中共享的驱动基因。（A） LCN2 的 Go 分析。（C） 对 LCN2 的 KEGG 分析。（B–D）LCN2 的 GSEA。CCA 患者中枢基因的预后价值
通过 K-M 生存分析评估了CCA 患者 DUOX2 与 LCN2 表达及总体生存期（OS）之间的关系。基于枢纽基因的最佳截断值，CCA 队列个体被分层为高表达组和低表达组。结果显示，DUOX2 和 LCN2 表达水平低的个体，其 OS 表现显著优于高表达水平者（p < 0.05，图 9A 和 B）。
基于DUOX2 和 LCN2 mRNA 高低表达水平，对 CCA_merge_data 队列 CCA 患者的生存分析。（A）74 名 CCA 患者的 OSK-M 曲线，按 DUOX2 表达的最佳截止风险评分分层。（B）74 名 CCA 患者的 OSK-M 曲线，按 LCN2 表达的最佳截止风险评分分层。基于枢纽基因的候选药物鉴定
候选药物通过药物特征数据库29 和“pRRophetic”R 软件包进行筛选。绝对相关系数大于 0.4 且 p 值小于 0.05 的药物被选为 IBD 与 CCA 联合治疗的潜在治疗方法。LCN2 可能参与多种化疗药物的耐药机制，其抑制作用可能增强药物敏感性。DUOX2 可能与氧化应激通路相关，高表达患者可能对 PF-4708671 等药物敏感性增加（见图 10A–J）。
DUOX2 和 LCN2 的药物敏感性分析（见图 10A–J）。免疫细胞浸润及其与共享枢纽基因的关系
使用 CIBERSORT 系统分析每个样本中的免疫细胞丰度，以考察免疫细胞在 IBD 和 CCA 复杂发病机制中的分布特征及潜在作用。图 11A 和图 B 清晰显示了 IBD 和 CCA 患者样本中 22 种免疫细胞类型的相对丰度。详细的比较分析表明，M2 巨噬细胞和静息记忆 CD4⁺ T 细胞在 IBD 和 CCA 患者中占据了相当大比例的免疫细胞。这些发现表明两种疾病中免疫细胞浸润存在潜在的共同机制。
炎症性肠病和 CCA 中的免疫浸润分析。（A）每个 IBD 样本中 22 种免疫细胞类型的相对丰度。（B）每个 CCA 样本中 22 种免疫细胞类型的相对丰度。（C）显示 IBD 样本中枢基因与免疫细胞相关性的热图。红色表示正相关，绿色表示负相关。（D）热图，展示了 CCA 样本中枢纽基因与免疫细胞之间的相关性。红色表示正相关，绿色表示负相关。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001。
基于此，进行了进一步的相关分析。结果表明，在两种疾病数据集中，LCN2 均与调控 T 细胞、M0 巨噬细胞和滤泡辅助 T 细胞呈正相关。同样，DUOX2 在两个数据集中与 M0 巨噬细胞呈正相关（见图 11C 和图 D）。临床样本中枢纽基因的验证
提取了 IBD 患者及正常对照组的肠道黏膜组织，以及 CCA 组织和邻近非肿瘤组织，以验证临床样本中枢基因的表达。进行了 qRT-PCR 检测这些样本中DUOX2 和 LCN2 的表达。结果与之前的数据分析结果一致。与对照组相比，DUOX2 表达明显上调。IBD 患者的 LCN2 表达显著增加，CCA 患者表现出明显的上升趋势（见图 12A–D）。
枢纽基因的 qRT-PCR 验证。（A）验证 IBD 中 DUOX2 表达与对照组的差异。（B）验证 DUOX2 在 CCA 组与对照组的表达。（C）IBD 组与对照组 LCN2 表达的验证。（D）CCA 组与对照组 LCN2 表达的验证。ns，无显著性（P ≥ 0.05）;*P < 0.05;**P < 0.01。
总结
本研究首次通过转录组分析揭示了 IBD 和 CCA 之间基因-基因相互作用及潜在分子机制。通过基于机器学习的分析，LCN2 和 DUOX2 被鉴定为 IBD 和 CCA 中的共同特征基因，凸显了它们作为两种疾病的治疗靶点的潜力。研究结果表明，免疫失调、炎症反应和感染相关通路可能构成两种疾病的共同病理机制。！
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