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前药策略被认为是实现气体分子可控释放的有效途径之一。目前已开发的CO前药90%以上均为过渡金属羰基络合物（如CORM-1/2），但金属离子的生物毒性极大限制了其临床适用性。近年来，非金属CO前药设计通过光化学策略取得一定突破，特定的有机骨架（如3-羟基黄酮）在光激发下可通过C-C键断裂实现CO的精准释放。然而，光敏CO前药的体内应用受限于组织穿透深度不足及光毒性风险。为了解决光敏CO前药依赖光激活的固有缺陷，苏州大学季兴跃教授前期与柯亨特教授合作，提出“化学能激活CO前药策略”，利用H₂O₂与草酸酯反应产生的化学能激活光敏CO前药，有效克服了光照带来的固有缺陷，并实现CO靶向肿瘤的可控激活（Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202200974）。然而，该策略仍存在急需解决的问题：1）高能中间体“1, 2-二噁烷-3, 4-二酮”半衰期极短（~ ms），为确保CO的释放效率，草酸酯需过量使用（约为CO前药的十倍），可能引发毒副作用，且CO释放效率仅约50%。2）草酸酯聚合物的聚合度受合成条件影响，导致批次间差异较大，难以质量控制。为解决上述问题，课题组提出“基于邻近效应的化学能激活前药”策略，通过将草酸酯片段直接与光敏CO前药（硫代3-羟基黄酮）偶联，构建单分子前药，在邻近效应的促进下，使化学能高效转移激活CO前药。令人惊喜的是，此体系还伴随着H₂S的生成（图1）。

图1. 邻近效应促进的化学能激活前药策略（图源：Angew. Chem.）

作者首先对前药的结构进行了优化（表1），并使用CO检测器对其释放效率进行了检测，得到CEP12具有优异的CO释放效率（~97%，效率是之前策略的2倍）。此外，作者还进一步使用CO检测的“金标准”肌红蛋白等对CO的释放进行了确证。

表1. 前药结构的优化

（图源：Angew. Chem.）

作者在进行产物分析时，意外发现了HFT-P2的生成，暗示了此体系可能伴随H₂S的生成。随后，作者通过H₂S探针以及亚甲基蓝检测法证实了H₂S的生成。作者进一步监测了CEP12响应不同浓度H₂O₂的释放动力学以及对不同ROS的选择性，结果表明CEP12能够有效响应生理浓度H₂O₂（100 μM），并对H₂O₂具有特异性响应。

图2. 前药释放的CO/H₂S的机制和以及对CO/H₂S检测（图源：Angew. Chem.）

由于草酸酯片段容易水解，在进行体内递送时会失去激活前药的能力。因此，作者将其制备成胶束以增强其结构稳定性，并设想通过胶束纳米颗粒的EPR效应来增强肿瘤靶向性和渗透性。作者将前药制备成胶束后对其尺寸进行了表征，并验证了其响应H₂O₂释放CO/H₂S的能力。

图3. 胶束前药的表征和CO/H₂S释放（图源 Angew. Chem.）

随后，作者在4T1细胞上使用CO/H₂S荧光探针对胶束前药响应内源性H₂O₂释放CO/H₂S的能力进行验证。接着，作者评估了释放速率不同的前药CEP2（慢）和CEP12（快）以及只释放CO的CEP14对4T1细胞的毒性，结果表明，CO/H₂S释放速率快的CEP12具有更强的细胞毒性，揭示CO和H₂S在抑制肿瘤细胞增殖方面可能存在协同效应。此外，CEP12也能够有效激活细胞色素C释放而诱导细胞凋亡。

（图源：Angew. Chem.）

为了进行体内应用，作者先使用荧光探针对前药响应肿瘤部位内源性H₂O₂释放CO/H₂S的能力进行了评估。小鼠肿瘤组织切片以及小鼠活体成像的结果表明，前药可以高效响应内源性H₂O₂释放CO和H₂S。最后，作者在4T1小鼠肿瘤模型上进行了肿瘤抑制实验，结果表明，CEP2/12均能抑制肿瘤生长，并且释放CO/H₂S速率更快的CEP12能更有效抑制肿瘤生长。此外，相比于对照组，CEP前药还能有效抑制肿瘤的肺转移，证明了CO/H₂S联合气体治疗的优势。

（图源：Angew. Chem.）

针对CO与H₂S难以协同释放的共递送难题，苏州大学季兴跃教授/柯亨特教授/陈华兵教授团队合作提出了一种基于邻近效应促进的化学能激活前药策略。该策略通过将草酸酯片段与光敏CO前药进行偶联，构建了一种新型双前药分子，它能够高效响应病灶部位的H₂O₂，并同步释放CO与H₂S。这成功解决了传统物理混合两种前药因药代动力学与激活机制不同所导致的时空释放不同步问题，为最大化气体分子的协同治疗效果提供了全新解决方案。