今天为大家介绍近期发表的两篇基于 E3 连接酶 VHL 的分子胶开发工作，它们分别来自诺华和安进。让我们一起看看这两篇“背靠背”的工作有何异同。
这篇今年 6 月发表于 Nature Chemical Biology 的文章题为 “A small-molecule VHL molecular glue degrader for cysteine dioxygenase 1”，由 Novartis 的研究团队完成。
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探索除了已知的 CRBN 之外的新型分子胶降解剂 -
利用已有的 VHL 配体，寻找能诱导 VHL 与新型底物蛋白结合的小分子，实现选择性蛋白降解。
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蛋白芯片筛选发现 CDO1 为 VHL 分子胶靶点
目的：使用高密度蛋白芯片（ProtoArray）筛选能与 VHL 在特定小分子存在下发生相互作用的蛋白。
原理：ProtoArray 是一种商业化的高密度蛋白质芯片，由 Invitrogen（现 Thermo Fisher Scientific）推出。在本研究使用的版本中，一张芯片上固定了超过 9,000 种纯化的人源蛋白质。这些蛋白质通常是以 GST 融合蛋白或其他标签融合蛋白的形式，通过高通量重组表达和纯化后，机械点样到特制的载玻片上。图1. ProtoArray筛选流程
方法验证：使用 PROTAC MZ1（基于 VHL 的 BRD4 降解剂）作为阳性对照，成功鉴定出 BRD4 蛋白，证明该体系较为合适。图2. 体系验证
新化合物筛选：在 VHL 配体（化合物 2–4）存在下，CDO1（cysteine dioxygenase 1）被显著招募到 VHL。化合物 4（VH-032）表现出很强的诱导结合能力。 -
生化验证 CDO1 与 VHL 的分子胶依赖性结合
目的：通过 SPR、TR-FRET、NMR 等技术验证化合物 4 诱导的 VHL–CDO1 三元复合物形成。
结果：SPR 显示化合物 4 诱导的 VHL–CDO1 结合 Kd（ternary）≈ 0.82 μM。TR-FRET 和 NMR 进一步确认了复合物形成，且依赖化合物 4。 -
细胞水平验证 CDO1 的 VHL 依赖性降解
目的：验证化合物 4 能否在细胞内诱导 CDO1 的降解，并确认其依赖 VHL 和蛋白酶体。
结果：NanoBiT 和 HiBiT 实验显示化合物 4 能诱导 CDO1 降解（DC₅₀ ≈ 349 nM）。在 VHL 缺失的 786-0 细胞中，降解效应消失。蛋白酶体抑制剂（MG132）和 NAE1 抑制剂（MLN4924）均能阻断降解。图3. CDO1的降解依赖于泛素蛋白酶体途径
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CDO1 与 VHL 结合界面的预测与验证
目的：通过计算模拟和物种间序列比对，确定 CDO1 中与 VHL 结合的关键区域。
结果：通过蛋白-蛋白对接和 MD 模拟，预测出 CDO1 上的结合区域（如 R2, R4）。通过构建人-鲤鱼嵌合体 CDO1 蛋白，实验验证了 R2（D43–A48）和 R4（D162–N200）是关键结合区域。 -
构效关系（SAR）研究与三元复合物晶体结构
图4. 本文使用的化合物
SAR：化合物 8（NVS-VHL720）表现出最强的降解活性（DC₅₀ = 8 nM，降解率 98%）。
结构修饰包括（相较于起始化合物 4）：
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化合物 5：左侧 t-Bu 替换为 i-Pr，VHL 结合强度不变，CDO1 降解活性显著下降 -
化合物 7：右侧苯环扩展为萘环，VHL 结合强度略微下降，CDO1 降解活性提升 -
化合物 8：在化合物 7 的基础上，甲基噻唑替换为吡唑，VHL 结合强度不变，CDO1 降解活性显著提升 
三元复合物晶体结构： -
解析了 VHL–4–CDO1 和 VHL–8–CDO1 的晶体结构（分辨率分别为 2.9 Å 和 2.5 Å） -
化合物被完全包裹在 VHL 和 CDO1 之间，形成“O-ring”状疏水界面 -
CDO1 的 Q99 与化合物形成关键氢键，突变后结合和降解能力显著下降 图5. 三元复合物对SAR的支持
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蛋白质组学验证选择性
目的：通过质谱蛋白质组学分析化合物 8 对全蛋白组的影响，验证其选择性。图6. 蛋白质组学验证化合物降解选择性
结果：在 HUH-7 细胞中，50 nM 化合物 8 处理 24 小时后，仅 CDO1 被显著下调（>3.5 倍，P < 0.001）。
——小结1——
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本研究首次报道了 VHL 依赖性分子胶降解剂，并成功降解了 CDO1 -
CDO1 是一个新型底物（neosubstrate），其降解不依赖于其天然调控机制（半胱氨酸水平） -
该工作证明基于 VHL 打造分子胶是可行的 -
研究展示了蛋白芯片+计算模拟+结构生物学的多技术联合策略在分子胶发现中的强大潜力
2025 年 3 月，安进在 bioRxiv 发表了名为《Discovery of a VHL molecular glue degrader of GEMIN3 by Picowell RNA-seq》的研究论文，系统性地报道了一种新型 VHL 分子胶降解剂 dGEM3。
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dGEM3 的发现
从 VHL-focused DEL 中筛选能引起转录组变化的化合物，鉴定出具有分子胶潜力的候选分子。
方法与结果：
使用 Picowell 微流控平台对 ~26,000 个化合物进行 RNA-seq 初筛。再从一个包含 4,327 个分子的子库中选出 28 个显著改变转录组的化合物，将这些化合物重新合成后，通过 VHL 结合实验（NanoBRET）和 RNA-seq 验证，最终选出 dGEM3（高活性）和 dGEM-NEG（高亲和力 VHL 结合但无降解活性）。图7. 筛选流程 -
dGEM3 降解 GEMIN3 的验证
目的：确定 dGEM3 的降解靶点，并验证其依赖 VHL 和蛋白酶体途径。
方法与结果：
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TurboID：dGEM3 诱导 VHL 与 SMN 复合物多个亚基（包括 GEMIN3）接近 -
BioE3：确认 GEMIN3 和 SMN2 被 VHL 泛素化 -
全局蛋白质组学：dGEM3 处理 6 小时后，仅 GEMIN3 显著降解，且依赖 VHL（在 VHL 缺失细胞中无效） -
HiBiT 降解实验：dGEM3 以 DC₅₀ = 680 nM 降解 GEMIN3，Dmax 达 75%，且降解可被蛋白酶体、E1、VHL 抑制剂阻断
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dGEM3 是 VHL 与 GEMIN3 之间的分子胶
实验目的：验证 dGEM3 是否通过诱导 VHL 与 GEMIN3 形成三元复合物发挥作用。
方法与结果：
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NanoBiT assay：dGEM3 诱导 VHL 与 GEMIN3 形成三元复合物，EC₅₀ 为 560 nM（全蛋白）或 130 nM（ATP 结合域） -
结构域分析：GEMIN3 的 ATP 结合域（aa41–268）足以介导三元复合物形成 -
选择性验证：dGEM3 不招募其他 DEAD-box 解旋酶，显示高度选择性 图8. ATP结构域参与三元复合物的形成
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生化与生物物理验证
实验目的：在体外重构并定量分析 dGEM3 诱导的三元复合物及其泛素化活性。
方法与结果：
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HTRF assay：dGEM3 诱导 VHL 与 GEMIN3（41-268）形成三元复合物，EC₅₀ = 450 nM，无 hook 效应 -
tBRET ubiquitination assay：dGEM3 依赖性地诱导 GEMIN3 泛素化，需 ARIH1 和 UBE2L3 参与 -
SPR 分析：dGEM3 仅结合 VHL（KD = 217 nM），不直接结合 GEMIN3，且 VHL 与 GEMIN3 在无 dGEM3 时不结合。三元复合物 KD = 69 nM，动力学较慢（kon = 5.6×10⁴ M⁻¹s⁻¹, koff = 5.6×10⁻⁴ s⁻¹）
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GEMIN3 降解子（degron）的定位
实验目的：通过物种选择性分析确定 GEMIN3 中被 VHL 识别的关键区域。
方法与结果：
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斑马鱼 GEMIN3 不与 dGEM3/VHL 形成三元复合物，尽管其与人的序列同源性达 80% -
嵌合体实验锁定两个区域：GEMIN3ₐₐ219-220（loop）和 GEMIN3ₐₐ249-256（helix） -
这两个区域共同构成一个复合降解元，负责与 VHL 的相互作用
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结构-活性关系（SAR）与动力学分析
实验目的：通过 dGEM3 类似物研究结构变化对三元复合物动力学和降解效率的影响。
方法与结果：
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去除 RHS 对位氯（compound 5）完全丧失活性 -
去除 LHS 氧（compound 3）降低结合速率（k_on），降低降解效力 -
去除 RHS 邻位氯（compound 4）加快解离速率（k_off），显著降低 Dmax
结论：三元复合物的稳定性（尤其是 k_off）是降解效率的关键决定因素图9. 本文用到的化合物
——小结2——
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证明 VHL 在分子胶开发方向和 CRBN 拥有同样的潜力 -
Picowell RNA-seq + DEL 筛选是发现分子胶的有效策略 -
GEMIN3 降解的生物学意义还有待研究
——总结——
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诺华的工作从结合出发，将近万个不同种蛋白固定在一起同时筛选，能直接鉴定出分子胶。而安进从表型出发，筛选对转录影响较大的 VHL 类似物。这两种模式都需要稳健的高通量筛选体系 -
以 VH032 分子作为 hit 化合物，VHL 分子胶的改造方向在左（LHS）右（RHS）两侧，核心序列不变 -
不同物种，同一分子的效果不同，这在两篇文章中都有体现。利用这一特点，两篇工作都确定了介导三元复合物的结构域。值得一提的是，沙利度胺对小鼠也没有致畸性 -
两篇工作都试图确定 Degron 的特征，期待后续在蛋白质组中挖掘更多 VHL 可降解的蛋白 -
题外话：早在 2021 年诺华就报告发现了基于 VHL 的分子胶可以降解 CDO1，历经多年，终于文章正式发表
本篇写作时使用了豆包、deepseek
参考文献
[1] Tutter, A. et al. A small-molecule VHL molecular glue degrader for cysteine dioxygenase 1. Nat. Chem. Biol. (2025).
[2] Bushman, J. W. et al. Discovery of a VHL molecular glue degrader of GEMIN3 by Picowell RNA-seq. bioRxiv, 2025.2003.2019.644003 (2025).