12 个 HCC EV 特异性基因候选体的鉴定
作者建立了全面的数据分析流程，以识别 HCC EV 特异性基因标记（见图）。2）。 该流程始于 GEO 和 ArrayExpress 存储库中前所未有的庞大肝脏转录组数据集。该汇编从 8,685 个肝组织样本（称为 LiTA）中获得了 16,296 条基因表达谱。
在基因选择过程中，采用了以下四个步骤，在四种病因学比较中选择 HCC 组织中上调基因;ii）利用癌细胞系百科全书（CCLE）数据集筛选肝细胞系中高表达基因[29];iii）通过分化 MAP（DMAP）数据集排除免疫细胞中高度表达的基因[30];以及四）利用外泌 RBase 2.0 的 HCC EV RNA 测序数据，在 HCC EV 中选择高表达基因[31]。该多步方法产生了 16 个 HCC 特异性 EV 基因候选人（VPS72、TMEM106C、PRIM1、SPDL1、FLAD1、SMYD3、SORT1、ATAD2、SETDB1、H2AX、PUF60、TUBG1、STT3A、UBL4A、C8orf33 和 KLHL12）。
随后，作者进行了定量 PCR（qPCR）技术，测量人类 HCC 细胞系（HepG2）和 HD 白细胞（WBC）中选定的 16 个 HCC EV 特异基因候选的差异表达。选中了六个表现出顶级差异表达的基因（SORT1、ATAD2、H2AX、PUF60、TUBG1 和 UBL4A），其中 HepG2 细胞表达较高，白细胞表达较低（见图 2 热图）).此外，从作者之前的肝细胞癌 EV 特异基因面板中，鉴定出另外六个基因（ALB、APOH、FABP1、FGB、FGG 和 TF），因其在区分早期肝细胞癌与肝硬化方面表现优异。该面板最初改编自麻省总医院用于 HCC 循环肿瘤细胞的数字检测平台[32]。最终合并的 12 个 HCC EV 特异基因候选基因分别是：ALB、APOH、ATAD2、FABP1、FGG、FGB、H2AX、PUF60、SORT1、TF、TUBG1 和 UBL4A。 这一全面的数据分析流程确保所选基因特异于 HCC EV，并能有效区分血液背景基因。
利用 RNAscope 验证 12 个 HCC EV 特异性基因候选体在 HCC 组织中
为进一步验证 12 个 HCC EV 特异基因候选在 HCC 组织中与非肿瘤边缘的表达差异，作者采用 RNA-蛋白共检测辅助套件，实现同时进行原位 RNAscope 杂交（ISH）和免疫荧光。本研究共采集六组 FFPE 肝细胞癌组织及其各自的阴性手术切缘。具体来说，定制的 RNAscope ISH 探针能够检测和定量这些组织中 12 个 HCC EV 特异性基因候选。同时，CD147 的免疫荧光可以描绘肝细胞膜，以确认肝细胞的存在。最终合成的荧光显微照片具有极高的空间分辨率（图）。3A）允许对 12 个基因候选体在肝细胞癌组织与非肿瘤边缘之间的表达水平进行半定量分析（见图 3-B ）。这些结果进一步证实了 12 个 HCC EV 特异基因候选在 HCC 组织中的差异表达，并为利用这些基因开发 HCC EV 数字评分测定奠定了坚实基础。
利用 RNAscope 验证 12 个 HCC EV 特异性基因候选。对12 个 HCC EV 特异性 mRNA 候选物进行代表性 RNA 镜原位杂交及对 CD147（HCC 相关表面蛋白标记）的免疫荧光染色，均对 HCC 组织及其对应的阴性手术切缘进行了检测。B 12 个标记中 mRNA 染色阳性（强度等级 1 到 3）的细胞比例以条形图汇总。组间的统计显著性通过卡方检验确定。EV，细胞外囊泡;肝细胞癌，肝细胞癌
对 HCC EV 数字评分测定的线性研究，用于定量 12 个 HCC EV 特异基因候选
作为模型系统，HCC 细胞来源的 EV 通过超速离心从 HepG2 细胞的调质培养基中提取[21]。所得 HepG2 EVs 的表征遵循了国际细胞外囊泡学会（MISEV 2018）关于细胞外囊泡研究的最低限度信息指南[33]。HepG2 EVs 通过透射电子显微镜（TEM）和纳米粒子跟踪分析（NTA）进行了表征。这些发现共同验证了 EV 点击珠可用于点击化学介导的 HCC EV 固定。随后，作者利用合成血浆样本验证了两步 HCC EV 数字评分测定。如图 4A 所示，合成血浆样本通过将 10 微升 HepG2 EVs 连续掺入 90 微升 EV 耗尽的女性 HD 血浆中制备。库存溶液中 HepG2 EV 的数量是通过 NTA 测量 EV 计数确定的。在 0.1 mL 合成血浆中，掺有的 HepG2 EVs 被培养并标记为 14 μL 抗体组合，该混合物含 TCO-anti-Ep-Cop（200 ng）、TCO-anti-CD147（250 ng）和 TCO-anti-ASGPR1（500 ng），随后使用 EV 点击珠进行富集。富集的 HepG2 EVs 随后对三联 RT-dPCR 进行绝对定量，分别对 12 个 HCC EV 特异基因候选人进行绝对定量，包括 ALB、APOH、ATAD2、FABP1、FGB、FGGs、H2AX、PUF60、SORT1、TF、TUBG1 和 UBL4A。如图 4B 所示，稳健线性相关性（R2 > 0.在所有 12 个 HCC EV 特异性基因候选人中，在 0 – 6×109 HepG2 EVs/μL 范围内，观察到高峰 HepG2 EVs 水平与检测到 mRNA 拷贝数之间，R 平方值范围为 0.991 至 0.999。
HCC EV 数字评分测定的线性研究。利用合成血浆样本对 HCC EV 数字评分测定进行线性研究，该样本通过连续将 HepG2 EV 注入 EV 耗尽的 HD 血浆中制备。EV 点击珠被用于富集 HepG2 EVs，结合靶向 EpCAM、CD147 和 ASGPR1 的三种 TCO 抗体组合。进行了 RT-dPCR 以获得 12 个 HCC EV 特异基因候选人的绝对定量。B 检测到所有 12 个 HCC EV 特异性基因候选物的尖峰 HepG2 EV 浓度与 mRNA 拷贝数测量值之间存在强健线性相关性，浓度范围为 0 – 6 × 109 HepG2 EV 每μL，R 平方值范围为 0.991 至 0.999。ASGPR1，亚同蛋白受体 1;EpCAM，上皮细胞粘附分子;EV，细胞外囊泡;肝细胞癌（HCC）;HD，健康供体;RT-dPCR，逆转录数字 PCR;TCO，环辛烯
一项试点研究，从 12 个 HCC EV 特异基因候选中选出 6 个 HCC EV 特异基因并计算 HCC EV 数字评分
为了从 12 个 HCC EV 特异基因候选中选择排名靠前的 HCC EV 特异基因，作者进行了一项先导研究（见图）。5A）评估并优化 HCC EV 数字评分测定在区分早期或中期肝硬化与肝硬化的表现。作者从 35 名 Tx 未诊断的早期或中期 HCC（BCLC 0-B）患者和 35 名肝硬化对照患者（无 HCC）中收集了 70 份血浆样本，其中 HCC 患者的疾病窗口与 HCC TR 评估队列一致。纳入早期或中期 HCC 病例，确保在低疾病负担的 HCC 患者中检测到排名最高的 HCC EV 特异基因。此外，为增强检测肝细胞癌的前列基因特异性，作者将肝硬化患者纳入对照组，因为大多数肝细胞癌患者具有肝硬化的先天背景。患者的人口统计和临床特征详见。对于每个样本，富集的 HCC EVs 随后对 RT-dPCR 进行绝对定量，分别对 12 个 HCC EV 特异性基因候选物进行绝对定量。随后，作者分析了肝细胞癌与肝硬化之间的基因转录本表达（图 5B）。在 12 个 HCC EV 特异性基因候选中，有 6 个基因表达差异（P < 0.05，见图 5B），分别为 ALB、APOH、FGB、FGG、H2AX 和 TF。 作者在热图中总结了这 6 个 HCC EV 特异基因在 70 名患者的相对强度（见图 5C）。通过加权 Z 分数方法[21， 34]，生成了公式及各基因权重[35]（见图 5D），将 6 个基因读数整合为每位患者的 HCC EV 数字评分。每个基因的权重基于 HCC 患者平均基因拷贝（log2 转化后）相对于肝硬化患者的相对信噪比分配。所得 HCC EV 数字评分准确区分了早期或中期肝硬化病例与对照组（P < 0.0001;图 5E）。此外，与血清 AFP 结果相比，HCC EV 数字评分在早期或中期 HCC 检测方面表现有所提升（AUROC = 0.85,95%置信区间[CI] = 0.76–0.94，敏感度=85.7%，特异度=77.1%，见图 5F）。综合来看，作者成功验证了试点研究中的 HCC EV 数字评分测定，并生成了 HCC EV 数字评分以量化系统性 HCC 负荷，为非侵入性 HCC TR 评估铺平了道路。
一项试点研究，旨在从 12 个 HCC EV 特异基因候选中精炼 6 个 HCC EV 特异基因，并计算 HCC EV 数字评分。 答 ：为了精炼 12 个肝细胞癌 EV 特异基因候选中的 6 个 HCC EV 特异基因，进行了一项 HCC EV 数字评分测定试验的初步研究，以区分早期或中期移植未诊断 HCC（BCLC 0-B， n = 35）与肝硬化（n=35），其中肝癌病例的疾病窗口与 HCC TR 评估队列相符。B 鉴定出 6 个差异表达基因 ALB、APOH、FGB、FGG、H2 AX 和 TF，能够更好地区分早期或中期肝硬化的 HCC。C 热图总结了 6 个 HCC EV 特异基因在早期或中期肝硬化和肝硬化患者的相对强度。量表：对数 2（转录+1）。D 开发了加权 Z 分数公式及六个基因的权重，将 6 个基因读数整合进 HCC EV 数字评分。在该公式中，i 代表每个基因，权重基于 HCC 患者平均基因拷贝（log2 转化）相较于肝硬化患者的相对信噪比。E 箱型图总结了早期或中期 HCC 及肝硬化患者计算的 HCC EV 数字评分。HCC EV 数字评分的 F 接收者工作特征（ROC）曲线，用于区分早期或中期 HCC 及肝硬化患者（AUROC = 0.85,95%置信区间：0.76—0.94）。 AUROC，接收器工作特征曲线下的面积;EV，细胞外囊泡;肝细胞癌（HCC）;ROC，接收机工作特性;RT-dPCR，逆转录数字 PCR
建立 HCC EV TR 评分，用于区分手术或局部治疗后存活和不可存活的 HCC
接着作者评估了 HCC EV 数字评分公式的表现（见图。5D）通过区分治疗后可存活和非存活 HCC 进行 HCC TR 评估。从接受手术切除、LT 或局部治疗（如局部消融、TACE 或 TARE）的早期或中期 HCC 患者中采集了一对治疗前和术后血浆样本。通过 LT 后组织学或 LR-TR 算法确定病后疾病状态，将患者分为术后存活或不存活。这 100 名 HCC 患者的特征总结于表 1。培训组和验证组在人口统计学和临床特征（包括年龄、性别、种族/族裔、BLCC 分期及治疗方法）上相似。
在训练组（n = 49）中，每位 HCC 患者的治疗前和术后血浆样本接受了精炼的 HCC EV 数字评分测定（见图 6A），以定量 6 个 HCC EV 特异基因，并生成配对的治疗前和术后 HCC EV 数字评分（见图 6B）。接下来∆，通过用以下公式从治疗前评分减去患者的治疗后评分，计算出每位患者的 HCC EV 数字评分其中i 代表每个基因， 权重基于试点研究的相对信噪比分配。
建立 HCC 显现 TR 评分，用于区分训练集中的治疗后可存活和非存活 HCC（n=49）。每位 HCC 患者的术前和术后血浆样本均接受精细的 HCC EV 数字评分测定，生成相应的术前和术后 HCC EV 数字评分，并通过从术前评分中减去术后值计算∆HCC EV 数字评分。开发了一个逻辑回归模型，协同结合治疗后 HCC 数字评分和∆HCC EV 数字评分，建立它们的 HCC EV 评分。B 梯图总结了 33 名治疗后存活的 HCC 患者和 16 名治疗后无生命性的肝细胞癌患者的前期和治疗后 HCC 虚拟评分。C/D 总结 33 名术后存活性肝细胞癌患者及 16 名术后无活性肝细胞癌患者的 HCC EV 数字评分及 HCC EV TR 评分∆箱型图。虚线表示最佳截止点 0.76。HCC EV TR 的 E ROC 曲线，用于区分训练组中检测后可存活的 HCC 与治疗后不可存活的 HCC。F ROC 曲线，经过保留一组交叉验证，用于区分训练集中治疗后可存活的 HCC 与不可存活的 HCC。AUROC，即受试者工作特征曲线下的面积;EV，细胞外囊泡;肝细胞癌（HCC）;肝脏移植，LT;ROC，接收机工作特性;RT-dPCR，逆转录数字 PCR;经动脉化疗栓塞术（TACE）;TARE，跨动脉放射栓塞;TR，治疗反应;治疗，治疗
术后非存活性 HCC 在∆HCC EV 数字评分中位数下降显著大于术后存活 HCC（P = 0.002，图 6C）。开发了一个逻辑回归模型（见下文公式），协同结合治疗后 HCC EV 数字评分与∆ HCC EV 数字评分，建立 HCC EV TR 评分。
盒图（图）6D）表明，HCC 后续 EV TR 评分在治疗后可存活 HCC 中显著高于非存活 HCC（P < 0.0001）。总体而言，HCC EV TR 评分区分了治疗后可存活 HCC 与非可存活 HCC，AUROC 为 0.90（95% CI = 0.82 – 0.99;敏感度=81.8%，特异度=87.5%，准确率=83.7%;图 6E）在训练集的最优截止点（0.76）处。该模型 HCC EV TR 评分具有优异的校准和区分能力，C 统计量为 0.88，预测移植后存活的 HCC。对训练集进行一除外交叉验证，确认了模型的表现（AUROC = 0.90,95% CI = 0.82 – 0.99;敏感度 = 81.8%，特异度 = 81.3%;图 6F）。为进一步评估模型稳定性，作者实施了十倍交叉验证，结果 AUROC 为 0.85，且最小绝对收缩与选择算子（LASSO）惩罚回归，导致 AUROC 为 0.83。
验证 HCC EV TR 评分，用于区分验证集中的治疗后存活和不可存活 HCC
在从训练集中获得 HCC EV TR 评分公式后，作者在 51 名患者的验证集中进一步验证了其在 HCC TR 评估中的表现，其中包括 34 例移植后存活的 HCC 病例和 17 例移植后无活的肝细胞癌病例。图 7A 呈现了 51 名 HCC 患者的配对治疗前和术后 HCC EV 数字评分的梯形图。如图 7B 所示，移植后非存活 HCC 在∆HCC EV 数字评分中位数下降显著大于切除后可存活 HCC。如箱型图所示（图 7C），治疗后可存活 HCC 的 HCC EV TR 分数显著高于治疗后不可存活 HCC（P < 0.001），与训练集中观察到的模式相似（图 6D）。在验证组中，HCC EV TR 评分在区分治疗后可存活与不可存活 HCC 方面表现出较高的诊断表现，AUROC 为 0.88（95% CI：0.78 – 0.98;图 7 D）。在训练集定义的截止值 0.76 时，HCC EV TR 评分在检测有效 HCC 方面具有极高的准确性，灵敏度为 76.5%，特异性为 88.2%，准确率为 80.4%。在包含 98 名血清 AFP 数据患者的联合训练和验证组中，HCC EV TR 评分在区分术后存活和非存活 HCC 方面优于血清 AFP，AUROC 为 0.91（95% CI：0.84 – 0.97;图 7 E）展示了血清 AFP 在所有人群（训练组、验证组、所有患者及基线 AFP≥10 ng/mL 亚群体）中的表现，AUROC 范围为 0.51 至 0.69。此外，作者评估了六个 HCC EV 特异基因与血清 AFP 之间的相关性，后者是评估肿瘤存活能力的著名标志物。 结果显示，所有六个 HCC EV 特异基因均与血清 AFP 无显著相关性，强调了这些基因的独立诊断价值。HCC EV TR 评分与血清 AFP 水平、性别、肝病病因或治疗选项无相关性，表明作者的结果未受这些因素偏倚。进行了亚组分析，以评估 HCC EV TR 评分在不同治疗方式和肝病病因下的表现。结果显示，HCC EV TR 评分在亚组中依然稳健，AUROCs 范围在 0.82 至 0.91 之间，无论治疗方法或潜在肝病病因如何，强化了其广泛的临床适用性。
验证 HCC 心体 EVTR 评分，用于区分检测组中治疗后存活和不可存活的 HCC（n=51）。 一份梯图总结了 34 名术后存活 HCC 患者和 17 名术后无活病 HCC 患者的配对肝细胞癌前和术后肝细胞癌 EV 数字评分。B 箱型图总结了 34 名治疗后存活 HCC 和 17 名移植后无活性 HCC 患者的∆HCC EV 数字评分。C 箱型图显示了治疗后可行和不可行肝细胞癌的 HCC EV TR 评分。虚线表示训练集中计算的最佳截断值 0.76。D HCC EV TR 评分的 ROC 曲线，用于区分验证集中的治疗后可存活 HCC 与非存活 HCC。HCC、EV TR 评分、检测后血清 AFP 和∆AFP 的 E ROC 曲线，均为联合训练与验证组（98 名血清 AFP 数据患者）。P = 0.0002，较治疗后 AFP 为 0.0002，P < 为 0.0001，较∆AFP 为 0.0001，使用配对 DeLong 检验。AUROC，即受试者工作特征曲线下的面积;EV，细胞外囊泡;肝细胞癌（HCC）;TR，治疗反应;治疗，治疗
HCC 心肺移植 TR 评分及 HCC 患者的临床病程
为说明计算出的 HCC 情绪波动 TR 评分与每位 HCC 患者临床病程之间的关联，作者创建了“综合瀑布/游泳者图”。这些图表旨在展示 HCC 情绪波动 TR 评分与 LR-TR 算法在接受多种治疗干预的 HCC 患者中卓越的诊断表现。在训练集的“综合瀑布/游泳者图”中，81.8%的治疗后有效肝细胞癌和 87.5%的手术后非生存肝细胞癌与游泳者图中横断面影像数据确定的临床状态相符。同样，76.5%的治疗后存活者和 88.2%的非存活肝细胞癌患者在验证组中显示一致。此外，亚组分析还显示，HCC EV TR 评分在不同治疗选项中表现保持稳定。
六名 HCC 患者病后复发的病例研究，伴随假阴性横断面影像评估及 HCC EV TR 评分显示阳性
在本研究中纳入的 100 名 HCC 患者中，有 13 人经历了早期复发（即根据横断面影像评估定义为在治疗后 180 天内复发）。在这 13 名患者中，有 6 名表现出异常（见图。8）在初步横断面影像（MRI）评估与 HCC 能量波动 TR 评分读数之间。根据 LR-TR 算法，他们最初被归类为手术后不可存活的 HCC;但其 HCC EV TR 评分高于最佳阈值 0.76，表明疾病存活。后续影像学确认六例均存在存活病变，中位时间为 63 天。这六例临床病例凸显了 HCC 福音性 TR 评分的优异表现，能够更好地预测 HCC 患者的移植后复发，并补充传统横断面影像，准确区分移植后存活和不可存活的肝细胞癌。
六例 HCC 患者病后复发病例，横断面影像评估为假阴性，HCC 显现异常（HCC EV TR）评分为阳性。游泳者图展示了 6 名 HCC 患者的临床病史，这些患者的横断面影像评估与 HCC EV TR 评分显示存在差异。每条横线代表患者从初始治疗日期（x 轴）到切除后复发的时间线，基于横断面影像评估。蓝色三角形表示初始横断面成像的时间点。基于 LR-TR 算法，所有患者均被归类为术后无存活 HCC。然而，他们的 HCC 电价 TR 分数高于最佳门槛 0.76，表明治疗后仍具备可行状态。后续影像检查确认存在活性病变，符合 HCC EV TR Scores 的预测。经动脉化疗栓塞术（TACE）;TARE，跨动脉放射栓塞;治疗，治疗.
总结
总之，作者基于 HCC EV 数字评分测定法开发并验证了 HCC EV TR 评分，以准确区分治疗后可存活与非存活 HCC 病例。HCC EV TR 评分表现出卓越的敏感性和特异性，在训练和验证组中均表现优异。这种液体活检方法在早期发现 HCC 复发、增强现有横断面影像评估以及协助 HCC 患者的临床决策方面具有巨大潜力
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