导语
想发一篇10分以上的SCI，还想让这个思路能“举一反三”，换个方向就能再用一次？这听起来很奢侈，但“网络毒理学+分子对接”这套研究范式，正在让它成为现实。这套“纯生信”的打法，逻辑清晰、数据详实，是冲击高分期刊的稳定利器。近期，一篇发表于 International Journal of Surgery (IF: 10.1) 的文章堪称教科书级示范：作者运用该范式，系统揭示了环境内分泌干扰物对三种不同糖尿病微血管疾病的毒理机制。今天，我们就来深度拆解这篇雄文的思路，看它是如何巧妙实现“一稿多用”，助你掌握这个高分、高效的科研模板！
结果：
使用 SwissTargetPrediction 和 SEA 数据库预测了 12 种主要环境内分泌干扰物（EDCs）的靶点。合并并去除重复项后，确定了 1486 个独特的 EDCs 相关靶点。从 CTD、GeneCards 和 OMIM 中检索了与糖尿病肾病（DKD）相关的基因靶点，经过筛选后得到 9999 个独特靶点。使用 Venny 2.1.0 软件，识别出 843 个交集靶点（图 1 A），这些靶点可能通过 EDCs 的作用参与 DKD 的发病机制。 EDCs 与 DKD 的关联分析。(A) EDCs 靶点与 DKD 相关靶点的维恩图；(B) 通过 STRING 数据库构建的交集靶点蛋白质相互作用（PPI）网络；(C) 通过 Cytoscape 3.9.0 构建的交集靶点 PPI 网络；(D) 通过 MCODE 和 CytoHubba 插件识别的 Top 10 核心靶点；(E) 核心靶点的生物学过程分析；(F) 核心靶点的细胞组分分析；(G) 核心靶点的分子功能分析；(H) 核心靶点的 KEGG 通路分析。 为分析这些共同靶点，将 843 个共享靶点导入 STRING 数据库构建了蛋白质相互作用网络（图1 B），参数设置为“多个蛋白质”、“智人”和“高置信度最小相互作用分数”。这生成了一个包含 829 个节点和 13,999 条边的网络（图 1 C），突出了 EDC 相关毒性靶点与糖尿病微血管病变病理生理之间的复杂相互作用。 由于蛋白质相互作用网络中的蛋白质相互交互，因此它被表示为无向图。高密度区域，即模块，是具有生物学意义的聚类[ 24 ]。为进一步研究 EDC 在糖尿病微血管病变中的毒性机制，将网络导入 CytoScape 3.9.0，使用 MCODE 和 CytoHubba 插件进行聚类分析。基于度值确定了前 10 个核心靶点（图 1 D），因为这些靶点可能在 EDC 诱导的糖尿病微血管病变毒性中发挥关键作用。 使用 Metascape 平台对与 EDC 诱导的 DKD 毒性相关的 843 个候选靶点进行了 GO 和 KEGG 通路富集分析。GO 分析显示，在 BP 方面，候选靶点主要参与稳态、细胞凋亡和脂质代谢，而在 CC 方面，它们主要与突触、质膜区域和细胞表面相关。关于 MF，靶点主要与酶结合、激酶活性和腺苷酸结合相关。KEGG 通路富集分析根据 P 值确定了前 10 条通路，其中最显著的是癌症、趋化因子信号通路、细胞凋亡、钙信号通路和细胞色素 P450 介导的药物代谢通路。这些结果为 EDC 导致 DKD 毒性的潜在机制提供了宝贵见解，突出了疾病进展中涉及的关键 BP 和通路。 分子对接热图结果显示，环境内分泌干扰物（EDCs）与五个核心靶标（图2 A）具有强结合亲和力，包括 EGFR（PDB ID: 4Z21）、ALB（PDB ID: 6M4R）、MYC（PDB ID: 8X8S）、ESR1（PDB ID: 6V8T）和 HSP90AA1（PDB ID: 4L90）。选取结合能最低的前六个分子对接结果，使用 PyMOL[ 25 ] 进行可视化。值得注意的是，蒽与 EGFR 的相互作用涉及 G465、D555 和 A444 残基，而苯并[a]芘与 ALB 的 THR-435、LEU-434、HIS-93、PRO-213 和 GLY-216 残基相互作用。DEHP 与 MYC 的 GLN-169 残基结合，PFOA 与 ESR1 的 GLY-465 残基相互作用，三氯生与 ALB 的 GLY-467 残基结合（图 2 B）。 12 种环境内分泌干扰物（EDCs）与糖尿病微血管疾病（DKD）核心靶点的分子对接。 (A) 12 种 EDCs 与 Top 5 核心靶点的分子对接热图； (B) 使用 PyMOL 对结合能最低的分子对接结果进行可视化； a, 芘-EGFR； b, 苯并[a]芘-ALB； c, DEHP-MYC； d, 双酚 A-HSP90AA1； e, PFOA-ESR1； f, 三氯生-ALB； (C) 在数据库中验证核心基因的表达； a, DKD 组和正常组的 PCA 图； b, 两组间 EGFR 的表达； c, 两组间 ALB 的表达； d, 两组间 MYC 的表达； e, 两组间 ESR1 的表达； f, 两组间 HSP90AA1 的表达。 通过 HPA 数据库验证显示，与 EDC 诱导的 DKD 毒性相关的核心靶点——EGFR、MYC 和 ALB——主要位于管状结构中，在肾小球中未检测到。HSP90AA1 和 ESR1 在管状结构和肾小球中均未检测到（补充数字内容图2 A，细胞分布分析显示它们存在于内分泌组织中（补充数字内容图 2 B，亚细胞定位分析表明，EGFR 主要位于质膜，ALB 位于内质网，MYC 和 ESR1 位于核质，HSP90AA1 位于细胞质（补充数字内容图 2 C。 在GSE30528 数据集中，对与 EDC 诱导的 DKD 毒性相关的核心靶点进行 PCA 分析，显示正常组和 DKD 组之间存在明显差异，PCA1 解释了 25.99%的变异，PCA2 解释了 15.21%。在 DKD 中，EGFR、ALB 和 MYC 下调，而 ESR1 和 HSP90AA1 上调，尽管差异没有统计学意义（图 2 C）。 从 CTD、GeneCards 和 OMIM 数据库中检索到 6276 个与 DR 相关的基因靶点。Venny 2.1.0 识别出 EDC 相关靶点和 DR 相关靶点之间的 474 个交集靶点（图 3 A），代表 EDCs 导致 DR 的潜在机制。 EDCs 与 DR 的关联分析。(A) EDCs 靶点与 DR 相关靶点的维恩图；(B) 通过 STRING 数据库的交集靶点 PPI 网络；(C) 通过 Cytoscape 3.9.0 的交集靶点 PPI 网络；(D) 通过 MCODE 和 CytoHubba 插件的 Top 10 核心靶点；(E) 核心靶点的生物过程分析；(F) 核心靶点的细胞组分分析；(G) 核心靶点的分子功能分析；(H) 核心靶点的 KEGG 分析。 通过将 474 个交集靶点导入 STRING 数据库构建了蛋白质相互作用网络（图 3 B），参数设置为“多种蛋白质”、“智人”和“高置信度”相互作用评分。这生成了一个包含 465 个节点和 6519 条边的网络（图 3 C），突出了 EDC 相关毒性靶点与 DR 病理生理之间的复杂相互作用。根据度值选择了前 10 个核心靶点（图 3 D），因为它们预计在 EDC 诱导的 DR 毒性中发挥关键作用。 使用 Metascape 平台对与 EDC 诱导的 DR 毒性相关的 474 个候选靶点进行了 GO 和 KEGG 通路富集分析。GO 分析显示，在生物过程（BP）中，靶点主要参与细胞凋亡、细胞死亡调控和信号通路正向调控（图3 E）。在细胞组分（CC）中，它们与分泌小体、外部包被结构和膜侧相关（图 3 F）。在分子功能（MF）中，它们与相同蛋白结合、蛋白酶结合和过渡金属离子结合相关（图 3 G）。KEGG 通路分析根据 P 值确定了前 10 条通路，其中显著通路包括 MAPK、ERBB、NOD 样受体信号通路和肾细胞癌通路（图 3 H）。这些结果揭示了 EDC 导致 DR 毒性的机制，强调了疾病进展中涉及的关键生物过程和通路。 分子对接热图结果显示，EDCs 与五个核心靶标（图4 A）具有强结合亲和力，包括 ALB（PDB ID: 6M4R）、EGFR（PDB ID: 4Z21）、MYC（PDB ID: 8X8S）、BCL2（PDB ID: 6MBE）和 CD4（PDB ID: 7DPO）。结合能最低的前六个分子对接结果使用 PyMOL 进行了可视化。值得注意的是，蒽与 BCL2 的 ILE-130 和 ASP-129 残基相互作用，DBP 与 BCL2 的 ASN-316 残基结合，而 PFOA 与 EGFR 的 ASN-183、LYS-207、ARG-206、THR-177、HIS-244、TYR-184 和 GLY-153 残基相互作用。此外，PFOA 与 MYC 的 G491、D547 和 R330 残基相互作用。敌敌畏与 ALB 的 ALA-424 和 VAL-373 残基相互作用，而多氯联苯与 ALB 的 GLU-546 和 HIS-577 残基相互作用（图 4 B）。 12 种 EDCs 与 DR 核心靶点的分子对接。(A) 12 种 EDCs 与 Top 5 核心靶点的分子对接热图；(B) 使用 PyMOL 对结合能最低的分子对接结果进行可视化；a, 芘-BCL2；b, DBP-BCL2；c, PFOA-EGFR；d, PFOA-MYC；e, 西维因-ALB；f, 多氯联苯-ALB；(C) 在数据库中验证核心基因的表达；a, DR 组和正常组的 PCA 图；b, 两组间 ALB 的表达；c, 两组间 EGFR 的表达；d, 两组间 MYC 的表达；e, 两组间 BCL2 的表达；f, 两组间 CD4 的表达。 HPA 数据库验证显示，BCL2 和 CD4（EDC 诱导的 DR 毒性的核心靶点）存在于内分泌组织中（补充数字内容图 3A，BCL2 定位于线粒体，CD4 定位于质膜（补充数字内容图 3B，其他靶点在《EDCs 对 DKD 的影响》中进行了验证。 在GSE60439 数据集中，主成分分析显示正常组和 DR 组之间存在明显分离，PCA1 解释了 43.39%的方差，PCA2 解释了 13.93%的方差。ALB、EGFR、MYC、BCL2 和 CD4 在 DR 患者中上调，但未达到统计学显著性（图 4 C）。 从 CTD、GeneCards 和 OMIM 数据库中收集了与 DSPN 相关的基因靶点。经过筛选和去除重复项后，确定了 7483 个相关基因靶点。Venny 2.1.0 分析显示有 623 个共同靶点（图5 A），这些靶点被预测为通过 EDC 暴露可能对 DSPN 发病机制有贡献的毒性靶点。 EDCs 与 DSPN 之间的关联分析。(A) EDCs 靶点与 DSPN 相关靶点的维恩图；(B) 通过 STRING 数据库的交集靶点 PPI 网络；(C) 通过 Cytoscape 3.9.0 的交集靶点 PPI 网络；(D) 通过 MCODE 和 CytoHubba 插件的 Top 10 核心靶点；(E) 核心靶点的生物过程分析；(F) 核心靶点的细胞组分分析；(G) 核心靶点的分子功能分析；(H) 核心靶点的 KEGG 分析。 通过将 623 个交集靶点导入 STRING 数据库构建了 PPI 网络（图 5 B），设置参数为“多种蛋白质”、“智人”和“高置信度”的最小交互分数。分析生成了一个包含 613 个节点和 9241 条边的网络（图 5 C），展示了 EDC 相关毒性靶点与 DSPN 病理生理之间的复杂相互作用。根据度值，选择了前 10 个核心靶点（图 5 D），预计在 EDC 诱导的 DSPN 毒性进展中发挥关键作用。 Metascape 平台对与 DSPN 中 EDC 毒性相关的 623 个候选靶点进行了 GO 和 KEGG 分析。GO 分析显示这些靶点主要参与稳态、对氧化合物的反应和细胞凋亡（BP）；质膜、细胞表面和突触（CC）；以及酶结合、蛋白质结合和核苷酸结合（MF）。KEGG 分析揭示了包括趋化因子信号通路、细胞凋亡、ERBB、VEGF、JAK-STAT 和 II 型糖尿病在内的主要通路。这些发现为与 DSPN 毒性相关的生物学过程和通路提供了见解。 分子对接热图显示 EDCs 与五个核心靶标（ALB，PDB ID: 6M4R；EGFR，PDB ID: 4Z21；MYC，PDB ID: 8X8S；ESR1，PDB ID: 7UJW；BCL2，PDB ID: 6RJP）之间存在强结合亲和力（图6 A）。使用 PyMOL 可视化了六个最低结合能相互作用。草甘膦与 ALB 的 GLY-945 和 ASP-946 相互作用，DEHP 与 EGFR 的 GLU-852、TYR-210、CYS-863 和 LEU-864 结合。PFOA 与 EGFR 的 VAL-1941 结合，西维因与 ALB 的 LYS-1960 和 VAL-1941 相互作用，三氯沙与 ALB 的 ILE-1787 和 ESR1 的 LEU-95、HIS-96 结合（图 6 B）。 12 种 EDCs 与 DSPN 核心靶标的分子对接。(A) 12 种 EDCs 与前 5 个核心靶标的分子对接热图；(B) 使用 PyMOL 对结合能最低的分子对接结果进行可视化；a, 草甘膦-ALB；b, DEHP-EGFR；c, PFOA-EGFR；d, 丁硫威-ALB；e, 三氯生-ALB；f, 三氯生-ESR1；(C) 在数据库中验证核心基因的表达；a, DSPN 组和正常组的 PCA 图；b, 两组间 ALB 的表达；c, 两组间 EGFR 的表达；d, 两组间 MYC 的表达；e, 两组间 ESR1 的表达；f, 两组间 BCL2 的表达。 与 EDC 诱导的 DSPN 毒性的关联枢纽靶点在《EDCs 对 DKD 的影响》和《EDCs 对 DR 的影响》中得到了验证。在GSE95849 数据集中，主成分分析（PCA）显示正常组与 DSPN 组之间存在明显差异，其中 PCA1 解释了 24.16%的方差，PCA2 解释了 17.60%的方差。EGFR 在 DSPN 患者中上调，但未达到显著水平。ALB 和 ESR1 下调，而 MYC 和 BCL2 上调，且存在显著差异（P < 0.05）（图 6 C）。
总结
这项研究整合了网络毒理学、分子对接和生物信息学，以推进对环境内分泌干扰物（EDCs）的研究。它为 EDCs 在糖尿病微血管疾病（DmiVD，包括糖尿病肾病 DKD、糖尿病视网膜病变 DR 和糖尿病神经病变 DSPN）发展中的致病机制提供了新的见解。未来针对 EDCs 的策略，如开发消除 EDCs 或抑制其作用的药物，可能为预防治疗糖尿病微血管疾病（DmiVD，包括糖尿病肾病 DKD、糖尿病视网膜病变 DR 和糖尿病神经病变 DSPN）提供新的途径 。
