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SH3BGRL3 在公共数据库分析中上调并与胃癌的预后不良相关
使用 HPA 和 GEPIA 的数据，对正常人类组织和癌症中的 SH3BGRL3 表达进行了全面分析。结果表明，SH3BGRL3 在人类组织和癌症中广泛分布（Fig. S3 ）。使用数据分析平台 TIMER 分析的数据集包括 415 个 TCGA_STAD 样本和 35 个相应的正常样本。结果揭示，与相应的正常组织相比，SH3BGRL3 在多种恶性肿瘤中显著上调，包括胃癌（P<0.05; Fig. 1A ）。此外，HPA 的单细胞分析显示，SH3BGRL3 在正常胃粘液分泌细胞中的表达较弱，低于免疫细胞和肌纤维细胞（ Fig. 1B ）。
使用不同数据库对 GC 中 SH3BGRL3 的表达和预后分析。(A)肿瘤免疫估计资源显示 SH3BGRL3 在多种人类癌症中显著异常表达，包括 GC。(B)单细胞分析表明 SH3BGRL3 在正常胃上皮细胞中表达较弱。Kaplan-Meier 生存曲线显示 SH3BGRL3 表达与 GC 的(C)总生存期和(D)无进展生存期显著相关。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 非配对t检验。SH3BGRL3, SH3结构域结合富谷氨酸蛋白样3; GC, 胃癌; TPM, 每百万转录本; nTPM, TPM数量; UMAP, 统一流形逼近与投影; HR, 风险比; CI, 置信区间。
随后，使用 GEO 数据库评估了 SH3BGRL3 表达对胃癌预后的影响。分别使用 875 和 498 例胃癌样本分析了 SH3BGRL3 表达与总生存期（OS）和无进展生存期（PPS）之间的关联。Kaplan-Meier 生存曲线显示，SH3BGRL3 高表达与胃癌患者较差的 OS（P<0.0001;Fig. 1C ）和 PPS（P<0.0001; Fig. 1D ）显著相关。SH3BGRL3 高表达患者的死亡风险是低表达患者的 1.78 倍。高 SH3BGRL3 组的 OS 中位时间为 23.6 个月，而低表达组的 OS 中位时间为 70.2 个月。与 OS 结果平行，SH3BGRL3 高表达患者的复发风险是低表达患者的 2.71 倍。在高 SH3BGRL3 组中，PPS 中位时间为 4.9 个月，而在低表达组中，PPS 中位时间为 14.8 个月。
此外，分层分析显示，具有病理肿瘤-淋巴结-转移（pTNM）分期 III 期、pTNM 分期 IV 期、淋巴结转移、肠型组织学、男性性别和无 HER-2 扩增特征的胃癌患者，可根据 SH3BGRL3 表达水平分为不同预后组。低 SH3BGRL3 表达病例的总体生存期（OS）显著长于高表达病例（Fig. S4 ）。这表明 SH3BGRL3 的高表达是胃癌患者预后不良的因素。
高 SH3BGRL3 表达与 EBV 阴性胃癌（EBVnGC）患者的高术前血糖浓度和侵袭性临床病理特征相关
由于 SH3BGRL3 的 mRNA 水平在胃癌中上调，本研究随后评估了胃癌中 SH3BGRL3 蛋白的表达。首先，采用 TMA 免疫染色法检测非选择性胃癌和邻近正常胃组织（Fig. 2 ）中 SH3BGRL3 蛋白的表达。正常胃上皮细胞中 SH3BGRL3 蛋白呈弱染色或无染色，与单细胞测序结果相似（ Fig. 2A ）。相比之下，淋巴细胞和肌成纤维细胞的细胞质中染色更强（ Figs. 2A 和 S5C ），以及胃癌细胞的细胞质中染色更强（ Figs. 2B 和 S5C ）。随后，由于 EBV 阳性胃癌中富含淋巴间质（ Fig. S5A and B ），本研究评估了 SH3BGRL3 在 EBV 阴性胃癌（EBVnGC）中的作用。进行了 EBER 原位杂交（ISH）检测，并筛选 EBV 阴性病例进行进一步分析。最终，纳入了 398 例具有完整临床病理和随访数据的 EBVnGC 患者，包括 287 例（72.1%）男性患者和 111 例（27.9%）女性患者（ Table I ）。男女比例为 2.5:1，年龄范围在 27 至 89 岁之间，中位年龄为 63 岁。在 398 例患者中，201 例死亡，平均随访时间为 45.58 个月（范围从 1 至 87 个月）。
SH3BGRL3 在 EB 病毒阴性胃癌中的表达分析。图(A)为正常胃组织（原始放大倍数，×20 和×400）的代表性图像，图(B)为 GC 肿瘤组织中不同 SH3BGRL3 表达的代表性图像（原始放大倍数，×20 和×400）。代表性图像的 AOD 值为特定数值。与正常胃组织相比，GC 组织中 SH3BGRL3 (C)蛋白和(D) mRNA 表达更高。SH3BGRL3 表达在具有(E)更高肿瘤萌芽、(F)存在穿透浆膜、(G)更高 T 分期和(H)血糖水平>6.1 mmol/l 的 GC 患者中显著升高。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。SH3BGRL3，SH3结构域结合富谷氨酸蛋白样3；T，肿瘤；AOD，平均光密度。
对于 SH3BGRL3 的表达，正常胃上皮细胞的平均吸光度值（AOD）为 0.0348±0.0129（范围，0.017–0.071；Fig. 2A ）。此外，GC 组织中 SH3BGRL3 染色的平均 AOD 为 0.0792±0.0445（范围，0.019–0.292； Fig. 2B ），显著高于正常胃上皮细胞（P<0.0001； Fig. 2C ）。SH3BGRL3 的 mRNA 水平也显示出在 EBVnGC 组织中显著上调，与其对应的正常组织中相比（P=0.039； Fig. 2D 和 Table SIII ）。此外，高 SH3BGRL3 表达与更高的 BUD（P=0.001； Fig. 2E ）、存在穿透浆膜（P=0.0021； Fig. 2F ）、更高的肿瘤（T）分期（P=0.0008； Fig. 2G ）以及血糖水平>6.1 mmol/l（P=0.0096； Fig. 2H ）相比低 SH3BGRL3 表达有显著关联。
高 SH3BGRL3 表达是 EBVnGC 患者的一个独立不良预后因素
为进一步评估 SH3BGRL3 在 EBVnGC 中的作用，本研究将 SH3BGRL3 表达分为高表达组和低表达组（截断值=0.0467，使用 RStudio 软件计算）。结果显示，313 例为高表达，85 例为低表达。与低表达相比，高 SH3BGRL3 表达显著与肿瘤穿透浆膜（P<0.0001）、神经周围浸润（P<0.001）、血管淋巴栓塞（P<0.01）、病理 T 分期（P<0.0001）、病理淋巴结分期（P<0.01）、pTNM 分期（P<0.001）和高 BUD（P<0.0001）相关。此外，与低 SH3BGRL3 表达相比，高 SH3BGRL3 表达显著与 EGFR 表达升高相关（P=0.013；Table I ）。
随后，分析了 EBVnGC 患者中 SH3BGRL3 蛋白表达与预后的关系。Kaplan Meier 分析表明，SH3BGRL3 表达是 EBVnGC 患者的一个重要预后因素。与低表达者相比，高表达的 EBVnGC 患者的总生存期（OS）更差（Logrank=15.085；P<0.0001；Fig. 3A ）。此外，亚组分析表明，与低表达的EBVnGC患者相比，高表达的EBVnGC患者在以下亚组中具有更差的OS率：TNM I–II期（Logrank=11.037；P<0.001； Fig. 3B ）、男性（Logrank=11.459；P<0.001； Fig. 3C ）、年龄≤65岁（Logrank=14.352；P<0.001； Fig. 3D ）、世界卫生组织（WHO）分级1–2级（Logrank=15.222；P<0.0001； Fig. 3E ）、无神经周围浸润（Logrank=9.231；P<0.01； Fig. 3F ）、劳伦肠型（ 20 ）（Logrank=15.517；P<0.0001； Fig. 3G ）、高BUD（Logrank=4.099；P=0.038； Fig. 3H ）和错配修复功能良好状态（Logrank=15.240；P<0.0001； Fig. 3I ）。此外，多变量Cox分析表明，SH3BGRL3表达是EBVnGC患者的独立预后因素。 表达 SH3BGRL3 水平高的患者与表达 SH3BGRL3 水平低的患者相比，死亡风险增加[风险比（HR），1.666；95%置信区间（CI），1.093–2.541；P=0.018； Table II ]。
根据 SH3BGRL3 表达情况对 Epstein-Barr 病毒阴性胃癌患者进行 Kaplan-Meier 生存分析。以下亚组生存分析：(A)全部入组队列；(B)pTNM 分期 1-2 期；(C)男性性别；(D)年龄≤65 岁；(E)WHO 分级 G1-2 级；(F)无神经周围浸润；(G)肠型胃癌；(H)肿瘤微乳头增多；(I)错配修复功能正常。SH3BGRL3，SH3 结构域结合富谷氨酸蛋白样 3；pTNM，病理肿瘤-淋巴结-转移；WHO，世界卫生组织；G，分级；SH3BGRL3-H，SH3BGRL3 高表达；SH3BGRL3-L，SH3BGRL3 低表达。
.随后，构建了一个预测 EBVnGC 患者 3 年和 5 年生存概率的预后列线图，包括在采用向后法进行的多变量 Cox 回归分析中 P<0.1 的参数。最终，列线图整合了 8 个因素，包括世界卫生组织分级（HR，1.480；P=0.058）、劳伦分型（HR，0.662；P=0.038）、神经周围浸润（HR=1.534；P=0.008）、癌栓（HR，1.741；P=0.038）、pTNM 分期（HR，2.953；P<0.001）、BUD（HR，1.840；P=0.012）、术前血糖水平（HR，1.515；P=0.009）和 SH3BGRL3 表达（HR，1.666；P=0.018； Table II 和 Fig. 4A ）。结果揭示，列线图的预测准确性良好，C 指数为 0.740（95% CI，0.706–0.773）。3 年和 5 年生存预测的校准曲线表明，预测概率与实际观察结果之间具有良好的准确性和一致性（ Fig. 4B and C ）。这些结果表明，列线图在预测预后方面具有良好的区分能力和可靠性。
预测 EBVnGC 患者预后的列线图。（A）预测 EBVnGC 患者 3 年和 5 年总生存期的列线图，包括世界卫生组织分级、劳伦分型、神经周围浸润、肿瘤栓、pTNM 分期、肿瘤萌芽、血糖水平和 SH3BGRL3 表达等参数。通过将每个变量的相应得分相加计算总分，总分预测患者 3 年或 5 年的生存概率至最低生存率刻度。列线图校准（B）3 年总生存期和（C）5 年总生存期。EBVnGC， Epstein-Barr 病毒阴性胃癌；OS，总生存期；WHO，世界卫生组织；pTNM，病理肿瘤-淋巴结-转移；SH3BGRL3，SH3 结构域结合富谷氨酸蛋白样 3；IGC，肠型胃癌；nIGC，非肠型胃癌；Bud，肿瘤萌芽；Glu，血糖水平。
SH3BGRL3 的 DEGs 及其相关通路在胃癌中
本研究利用 SH3BGRL3 的 DEGs 分析并可视化 SH3BGRL3 在胃癌中的潜在机制。LinkedOmics 揭示共有 4,403 个基因（深红色点）与 SH3BGRL3 显著正相关，而 7,101 个基因（深绿色点）与 SH3BGRL3 显著负相关（Fig. 5A ）。筛选出的前 10 个正相关基因为 GNG5, NOP10, ZNF593, RHOG, RNASEK, VAMP8, TMSB0, PFN1, CAPZB 和 CLTB（ Fig. 5B ）。同时，筛选出的前 10 个负相关基因为 ZNF192, TTC21B, CELF1, ZBTB26, ADNP, ZNF445, FAM168B, KLHL15, ASH1L 和 NEU3（ Fig. 5C ）。
SH3BGRL3 及其相互作用网络的 功能富集分析。(A) 使用火山图可视化的 SH3BGRL3 差异表达基因（DEGs）。(B) 使用热图展示的 SH3BGRL3 前 10 个显著正相关基因。(C) 使用热图展示的 SH3BGRL3 前 10 个显著负相关基因。通过(D)基因本体（GO）和(E)京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析的 SH3BGRL3 差异表达基因。使用(F)蛋白质-蛋白质相互作用网络功能富集分析和(G)GeneMANIA 预测的 SH3BGRL3 相关网络。SH3BGRL3，SH3 结构域结合富谷氨酸蛋白样 3；DEGs，差异表达基因
使用 RStudio 软件进行了 GO 和 KEGG 通路分析，以评估与 SH3BGRL3 相关的基因的生物功能和分子机制。选择了前 1,000 个正负相关的 DEG 进行 GO 和 KEGG 通路分析。在 GO 分析中，BP 术语涉及 ATP 代谢过程、电子传递链和 OXPHOS。CC 术语涉及线粒体蛋白复合物、核糖体和核糖体亚基。此外，MF 术语在转录共调节活性、核糖体结构成分和电子传递活性中发挥重要作用（Fig. 5D ）。KEGG 通路分析表明，SH3BGRL3 相关的信号通路在多种神经退行性疾病、核糖体、糖尿病心肌病、OXPHOS、2019 冠状病毒病、结直肠癌和蛋白酶体中富集（ Fig. 5E ）。此外，通过 STRING（ Fig. 5F ）和 GeneMANIA（ Fig. 5G ）在线服务器预测了 SH3BGRL3 的相关相互作用网络。结果表明，SH3BGRL3 蛋白和 mRNA 共表达，并与 ErbB1/EGFR 和 ErbB2/HER-2 物理相互作用。
为了进一步评估 SH3BGRL3 表达可能富集的生物学通路，本研究基于 TCGA_STAD 和 MSigDB 数据集，在 SH3BGRL3 低表达组和高表达组之间进行了 GSEA 分析。根据主要结果，高表达组中 OXPHOS 和蛋白酶体的正向调控基因集显著多于低表达组（Fig. 6A and B ）。相比之下，与高表达组相比，低表达组中赖氨酸降解（ Fig. 6C ）、胰岛素信号通路（ Fig. 6D ）、ATP 合成酶（ATP）-结合跨膜转运蛋白（ Fig. 6E ）和 mTOR 信号通路（ Fig. 6F ）的负向调控基因集显著富集。
使用基因集富集分析对胃癌中的 SH3BGRL3 进行功能富集分析。高 SH3BGRL3 表达与(A)氧化磷酸化和(B)蛋白酶体通路相关的基因集相关，低 SH3BGRL3 表达与(C)赖氨酸代谢通路、(D)胰岛素信号通路、(E)ABC 蛋白转运体和(F)mTOR 通路相关。SH3BGRL3，SH3 结构域结合富谷氨酸蛋白样 3；ABC，ATP 合成酶（ATP）结合转运蛋白；mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。
TIMER 分析结果揭示，高 SH3BGRL3 表达与更多巨噬细胞（P<0.001）和自然杀伤（NK；P<0.0001）浸润细胞呈正相关，但与 CD4+ T（P<0.001）和 CD8+ T（P<0.001）浸润细胞呈负相关 ( Fig. 7A )。TISIDB 分析结果证明，SH3BGRL3 的表达广泛影响 28 种恶性肿瘤肿瘤微环境（TME）内的浸润免疫细胞 ( Fig. 7B )。进一步分析显示，SH3BGRL3 表达与浸润巨噬细胞、活化树突状细胞、NK-CD56dim 亚群和单核细胞之间存在显著正相关（P<0.0001； Fig. 7C ）。
SH3BGRL3 表达水平与胃癌中浸润免疫细胞之间的关联（来自 TIMER 和 TISIDB 数据库）。(A) TIMER 显示 SH3BGRL3 表达与 CD4+ 和 CD8+ T 细胞呈负相关，与巨噬细胞和 NK 细胞呈正相关。TISIDB 显示(B) SH3BGRL3 与恶性肿瘤（包括胃癌）肿瘤微环境中的浸润免疫细胞相关，以及(C) SH3BGRL3 表达与巨噬细胞、树突状细胞、NK CD56dim 细胞和单核细胞呈正相关。SH3BGRL3，SH3 结构域结合富谷氨酸蛋白样 3；TIMER，肿瘤免疫估计资源；TISIDB，肿瘤与免疫系统相互作用数据库；NK，自然杀伤；TPM，每百万转录本。
总结
总之，本研究表明 SH3BGRL3 在胃癌组织中显著上调。此外，SH3BGRL3 是胃癌的不良预后因素，尤其是在 EBV 阴性胃癌中，它可作为胃癌患者的潜在生物标志物。。
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