大家好，今天跟大家分享一篇题为TGF-β signaling redirects Sox11 gene regulatory activity to promote partial EMT and collective invasion of oncogenically transformed intestinal organoids（TGF-β信号重定向Sox11基因调控活性，以促进部分上皮-间质转化（EMT）和癌基因转化的肠道类器官的集体侵袭）肿瘤细胞浸润周围组织时常经历部分上皮-间充质转化(pEMT)并采用集体侵袭模式，但其调控机制和相互联系尚不清楚。
01
研究背景
浸润周围组织的癌细胞经常经历部分上皮-间充质转化 （pEMT） 并采用集体侵袭模式。这些表型性状如何被调节和相互关联仍未得到充分探索。在这里，我们使用具有结直肠癌 （CRC） 驱动突变的肠道类器官作为模型系统来研究 TGF-β1 诱导的 pEMT 和集体侵袭的机制基础。通过 scRNA-seq，我们鉴定了代表广泛 pEMT 谱的多个细胞亚群，其中最先进的 pEMT 状态与集体侵袭中前导细胞的转录谱和人类 CRC 的不良预后间充质亚型相关。
生物信息学分析确定 Sox11 是一种转录因子基因，其表达在潜在前导/pEMT 中达到峰值高细胞。免疫荧光染色证实 Sox11 在 TGF-β 1 处理的类器官侵袭前沿的细胞中表达。功能丧失和过表达实验表明，Sox11 对于 TGF-β1 诱导的 pEMT 和集体侵袭是必需的，但还不够。在人 CRC 样本中，SOX11 表达升高与晚期肿瘤分期和较差的预后相关。
出乎意料的是，除了协调对 TGF-β1 的类器官反应外，Sox11 还控制了与正常肠道功能和肿瘤抑制相关的基因的表达。显然，Sox11 嵌入在几个不同的基因调控回路中，有助于肠道组织稳态、肿瘤抑制和 TGF β介导的癌细胞侵袭。
见图一
在 TGF-β1 处理的 TKA 类器官中检测广谱瞬时状态和 pEMT 终点。
图一
scRNA-seq 工作流程的示意图概述。该图是使用 BioRender.com 生成的。
B TGF-β1 处理 0、24、48 和 72 小时和 scRNA-seq 后 931-TKA 类器官细胞的无监督聚类和 UMAP 可视化。
C 根据 10x Genomics 样本指数推导出的 TGF-β1 处理时间对 UMAP 中的单个类器官细胞进行注释。颜色代码代表 TGF-β1 处理时间。来自 931-TKA 类器官的 scRNA-seq 结果的 RNA 速度分析 。
（D） 和基于 PAGA 的轨迹预测 （E）。RNA 速度图中的箭头预测细胞状态的起点和投影到 UMAP 空间的未来进程方向。线条的粗细表示集群之间的连接强度。
F 热图显示了在类器官细胞簇的基因表达谱中富集的 MSigDB 标志基因集。红蓝色标表示 z 分数。通过 MSigDB 和 decoupleR 评估 G TGF-β 通路活性。使用 SCANPY 函数：score_gene 函数通过过度表示分析 （ORA） 确定富集，并在 UMAP 中可视化。EMT 特征的 H 表达由 MSigDB 和 decoupleR 评分并投影到 UMAP 空间。
I 小提琴图中 EMT 分数的 UMAP 集群特异性可视化。
J UMAPs 可视化用 TGF-β1 处理 0 、 24 、 48 和 72 小时的类器官细胞中上皮和间充质标记基因的表达水平。颜色代码表示指定基因的标准化计数 （Norm. counts）。
见图二
处于最先进 pEMT 状态的细胞表达前导细胞的特征。
图二
A 使用 SCANPY 对自定义前导细胞基因表达谱的表达进行评分。将获得的领导细胞分数投影到 UMAP 上。
B 小提琴图中领导细胞分数的 UMAP 簇特异性可视化。
C 在 UMAP 空间中可视化的示例性前导细胞基因的表达。色标代表指定基因的标准化计数 （Norm. counts）。
见图三
Sox11 是簇 2 细胞中表达最高水平的 TGF-β1 诱导转录因子，定位于 TKA 类器官侵袭性前沿的一层细胞。
图三
A 热图显示了来自溶剂 （Solv） 或 TGF-β1 处理的 931-TKA 和 947-TKA 类器官的联合时间分辨大量 RNA-seq 数据中表达增加的 TF 基因 [10]。所有小鼠 TF 均具有 log2选择至少在 TGF-β 1 刺激的一个时间点> 4 倍变化进行显示。将用 TGF-β 1 处理 6 h 和 24 h 的样品与处理开始时收获的样品（溶剂 0 h）进行比较。将用 TGF-β1 处理 48 h 和 72 h 的样品与在溶剂中保存 72 h 的样品进行比较。标准化对数2CPM 值用作基因表达单位。
B 轨迹图显示与溶剂或 TGF-β1 处理的 931-TKA 类器官细胞的 scRNA-seq 数据中 （A） 中相同的 TF 基因的簇表达。每个峰代表单个类器官细胞中给定基因的标准化计数。
C TGF-β1 处理 0、24、48 和 72 小时后 931-TKA 类器官细胞的无监督细胞聚集和 UMAP 可视化（上图）以及 SCENIC 预测的 Sox11 调节子活性投射到 UMAP 上（下图）。
D Sox11 在 TKA 类器官系（931-TKA、1308-TKA 和 1322-TKA）中的表达。将类器官包埋在 3 mg/ml 基质胶中，用溶剂或 TGF-β1 处理 72 h，然后进行 RNA 收集和 cDNA 合成。通过 qRT-PCR 评估 Sox11 的 RNA 水平，并通过 Eef1a1 的表达水平进行标准化。箱形图显示 26th至 75th数据的百分位数和中位数。点表示单个实验的结果 （n = 3）。单因子方差分析，***：p 值< 0.001。描述 FKBP12 的 CRISPR 介导的帧内敲入 （KI） 策略的 E 方案F36V 系列编码序列和流感病毒血凝素 （HA） 表位标签进入 Sox11 基因。上限方案和下限方案分别代表 WT 和改良的 Sox11。红色箭头表示 sgRNA 靶位点。FKBP12 系列F36V 系列用作降级标签。PGK 启动子驱动的新霉素抗性基因 （NeoR） 作为选择标记。F Sox11 在 Sox11-KI 克隆中的表达。Sox11-KI 克隆 KI22.3 和 KI22.39 用溶剂或 TGF-β1 处理 72 h。收获前两小时，类器官额外接受 DMSO 或 500 nM dTAGV-1.收集类器官进行蛋白质印迹分析，以监测 HA 标记的 Sox11 、磷酸化 Smad2/3 （pSmad2/3） 和总 Smad2/3 的表达。检测 Gsk3β 以控制相等的负载。显示了三个实验中一个的代表性结果 （n = 3）。MW：分子量标准品，单位为 kDa。将 G 931-TKA Sox11-KI 类器官接种在 3 mg/ml 基质胶中，并用溶剂或 TGF-β1 处理 72 小时，然后对指示的抗原进行整装免疫荧光染色和共聚焦显微镜检查。细胞核用 DAPI 复染。检查的焦平面位置显示在显微照片上方的方案中。带有罗马数字的框区域以更高的放大倍率显示。白色箭头表示类器官侵袭前沿的核 Sox11-HA 染色;空箭头表示类器官中心没有 Sox11-HA 染色。比例尺：100 μm。显示了来自三个实验中一个的代表性图像 （n = 3）。这些方案是使用 BioRender.com 生成的。
见图四
Sox11 是 TGF-β1 诱导的 pEMT 和集体侵袭所必需的。
图四
A Sox11 WT 和 KO 位点的结构。红色箭头标记了两个 sgRNA 的靶位点，用于删除大部分 Sox11 开放阅读框 （ORF）。UTR：未翻译区域。
B 用 TGF-β 1 处理 72 小时的 931-TKA 和 1308-TKA 类器官系的整体安装相差显微镜。用非靶向 （NT） sgRNA （931-TKA： NT6;1308-TKA： NT2） 处理的亲本系和克隆衍生类器官具有 WT Sox11 基因。KO 系在 Sox11 中携带双等位缺失 （931-TKA： KO3 和 KO17;1308-TKA： KO47 和 KO56）。比例尺：100 μm。显示了来自三个独立生物学重复之一的代表性图片。
C 如图所示，使用 Sox11 WT 和突变类器官系进行 transwell 侵袭测定的代表性图像。将类器官接种在 transwell 插入物上腔的 3 mg/ml Matrigel 中，并用 TGF-β1 处理 72 小时。通过结晶紫染色观察穿过 Matrigel 层并穿过 transwell 底膜的侵袭性类器官细胞。
D 使用 Sox11 WT 和突变类器官系定量 transwell 测定。通过 ImageJ （n = 3） 测量 （C） 中示例所示的侵袭类器官细胞覆盖的 transwell 膜面积。通过单因素方差分析评估统计显着性，ns：不显著;**： p 值 < 0.01;：p 值< 0.001。通过 qRT-PCR 测定指定 Sox11 WT 和突变类器官系中上皮 （Cdh1、Ephb3） 和间充质标志物 （Itga5、Fn1、Snai1、Zeb1） 的 E RNA 表达水平，并通过 qRT-PCR 测定并归一化为 Eef1a1 的表达水平 （n= 3） 的 S Package。箱形图显示数据的第 26 个到第 75 个百分位数和中位数。圆点表示单个测量的结果。相对 exp.： 相对表达式。单因素方差分析;ns：不显著;*： p 值< 0.05;**： p 值 < 0.01;：p 值< 0.001。F 通过蛋白质印迹分析测定指示的 Sox11 WT 和用溶剂或 TGF-β 1 处理 72 小时的突变类器官系中上皮标志物（E-钙粘蛋白、Ephb3）和间充质标志物（整合素 α5、纤连蛋白、Snail1、Zeb1）的蛋白表达水平。分析磷酸化 Smad2/3 （pSmad2/3） 和总 Smad2/3 量，显示 TGF β通路激活。检测 Gsk3β 用于控制相等的负载。MW：分子量标准品，单位为 kDa。图像是来自三个独立生物学重复之一的代表性示例。
见图五
大量 RNA-seq 揭示了 Sox11 在静息和 TGF-β1 刺激的类器官细胞中的多种功能。
图五
A 实验性设置。袜子11如图所示，将 WT 和突变类器官系接种在 3 mg/ml 基质胶中，并用溶剂或 TGF-β 1 处理 72 小时，然后进行 RNA 收集和下一代测序。该图是使用 BioRender.com 生成的。
B 所示条件下培养的指定 Sox11 WT 和突变类器官系的 RNA-seq 结果的主成分分析。颜色代码指定 Sox11 基因型。空符号和实心符号区分用溶剂或 TGF-β 1 处理 72 小时的样品。
C 热图显示指定的 Sox11 WT 和用溶剂或 TGF-β1 处理 72 小时的突变类器官系中的差异表达基因。具有 log 绝对值的基因2从大量 RNA-seq 结果中提取比较 Sox11 WT 和突变类器官系时，任何条件下表达> 1 倍变化和调整后的 P 值< 0.05。然后通过 z 分数转换对以百万计数 （CPM） 为单位的基因表达水平进行标准化，按预定数量的 12 个簇进行排序，并在热图中可视化。从聚类 1、2 和 8 中选择的基因显示在热图旁边。粗体类型标识重要性得分< 300 的 Sox11 调节因子的成员。颜色代码表示基因的 z 分数。
D 途径分析。检查了 （C） 中簇 1、2 和 8 的差异表达基因，以丰富来自 MSigDB Hallmark 和 Reactomes 数据集以及 GO 集合生物过程、细胞成分和分子功能的基因表达特征。通路分析的结果基于调整后的 p 值和比值比以综合分数给出，这反映了来自给定基因集的基因分数，显示 DEGs 之间的富集与相应集中的基因总数。颜色代码表示使用 Fisher 精确检验调整后的 p 值。
见图六
较高的 SOX11 表达与结肠和直肠腺癌的较短生存时间相关。
图六
A 从 UCSC Xena 浏览器中检索来自 TCGA 数据库的结肠腺癌 （COAD） 和直肠腺癌 （READ） 样本的基因表达矩阵，并将 COAD 和 READ 组合队列中的 SOX11 RNA 表达值可视化为箱形图。黑点显示单个样品中 SOX11 的表达。箱形图显示数据的第 26 个到第 75 个百分位数和中位数。使用 Mann-Whitney U 检验进行统计分析，ns：不显著。
B 根据肿瘤分期对来自 TCGA 数据库的 COAD 和 READ 基因表达矩阵进行分层，并显示 COAD 和 READ I、II、III 和 IV 期联合原发肿瘤中的 SOX11 表达水平。黑点显示单个样品中 SOX11 的表达。Mann-Whitney U 检验，ns：不显著;*： p 值 < 0.05;**： p 值 < 0.01;：p 值< 0.001。
C Kap lan-Meier图显示总生存期和无病间隔与高 [log2（FPKM-UQ + 1） > 3.842] 和低 [log2（FPKM-UQ + 1） < 3.842] SOX11 在 TCGA COAD 和 READ 队列中的表达。p 值采用对数秩法计算。
D COAD 和 READ 原发肿瘤联合转录组中指示的基因表达的相关性分析。每个橙色点表示一个单独的样本。线性回归线（红线），基于等级的 Spearman 相关系数和 p 值在每个图中都有注释。粉红色阴影区域表示 95% 置信区间。基因表达水平以对数表示2（FPKM-UQ + 1） 值。
E Box 图可视化了来自 TCGA 数据库的 COAD 和 READ 原发肿瘤的 CMS 分层转录组中指示的基因表达。每个黑点显示一个单独的样本。箱形图显示数据的第 26 个到第 75 个百分位数和中位数。使用 Mann-Whitney U 检验进行统计分析;：p 值< 0.001。
02
研究结论
值得注意的是，TKA 类器官精确复制了 pEMT 非原型体内实例的几个方面，即上皮标志物的持续表达、至少独立于单核 EMT-TF 以及 EMT 的不完全执行。因此，我们认为 TKA 类器官可以代表一种多功能的实验替代方案，以补充现有的原型 EMT 模型。
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