扩张型心肌病（DCM）主要受遗传因素的影响。是肌节和线粒体之间的相互调节与DCM的进展有关，但其机制尚不清楚。苏州大学胡士军团队研究了心肌肌钙蛋白T（cTnT）失调对DCM患者肌节-线粒体通讯的影响。研究表明，14-3-3蛋白和p44/42激酶活性的治疗靶点可能代表了DCM和其他与线粒体动力学异常相关的心脏疾病的有希望的策略。
扩张型心肌病（DCM）是一种多方面的疾病,其特征是在无异常负荷条件和冠状动脉疾病的情况下出现心室扩张和收缩功能障碍。啮齿动物研究极大地促进了对DCM病理生理学的理解，但动物和人类解剖学和生理学之间的差异限制了其实用性。诱导多能干细胞（iPSC）为模拟遗传性心脏病提供了一种有前途的方法。
心肌肌钙蛋白T（cTnT）由TNNT2基因编码，是心肌细胞中肌节组装、收缩和力产生所必需的。TNNT2变异与家族性DCM、肥厚性心肌病以及心源性猝死和心力衰竭风险增加相关。对ATP的生成和肌节功能至关重要的线粒体网络，受到线粒体动力学失衡的影响，导致心功能障碍和DCM。已有研究证明，TNNT2序列变异有助于异质性肌节组织和心脏功能障碍，提出了它们对线粒体形态和功能的影响的问题。通过探索这一方面，可为TNNT2序列变异导致的DCM发病机制提供新的视角，重点是肌节和线粒体之间的复杂的相互作用。
1、用患者特异性iPSC-CM体外模拟cTnT（p.K185E）序列变异相关DCM
将从健康和受DCM影响的家族成员中分离的真皮成纤维细胞分别重编程为cTnT WT（cTnTWT）和cTnT变体（cTnTK185E）iPSC；同时，通过CRISPR/Cas9生成等基因对照（cTnTCor）iPSC，再将其分化为携带cTnTWT、cTnTK185E或cTnTCor的心肌细胞。免疫荧光染色分析iPSC-CMs的肌节组织。结果显示，与cTnTWT CMs相比，cTnTK185E-CMs表现出明显的肌节混乱（图1A和1B）。接下来，使用带有可调水凝胶的牵引力显微镜平台，来测量iPSC-CMs的收缩力。与水凝胶上的cTnTWT-CMs相比，cTnTK185E-CMs的总峰值力和位移显著降低（图1C和1D），与临床DCM表型一致。因此，在cTnTK185E-CMs中成功地在细胞水平复制了DCM的病理表型，肌节紊乱和收缩功能减弱是导致DCM发病的关键因素。
2、cTnT（p.K185E）序列变异损伤cTnTK185E-CMs中的线粒体网络和代谢活性
接下来，研究了cTnT序列变异是否影响心肌细胞的线粒体形态、网络和功能。MitoTracker Red染色显示，cTnTK185E-CMs中的线粒体断裂，亚细胞肌丝结构紊乱和线粒体网络紊乱（图1E）。与cTnTWT-CMs和cTnTCor-CMs相比，cTnTK185E-CMs中的线粒体明显更短（图1F）。Seahorse XF24细胞外通量分析仪测量线粒体耗氧率（OCR），评估线粒体功能。与对照组相比，cTnTK185E-CMs的基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸明显降低（图1G-1J）。JC-1染色测量线粒体膜电位。结果显示，cTnTK185E-CMs的红/绿荧光强度比显著降低，表明这些细胞中的线粒体去极化（图1K和1L）。此外，基因表达分析显示，cTnTK185E-CMs中线粒体呼吸链复合物I和II的水平受损（图1M和1N）。这些发现共同说明了cTnTK185E-CMs中线粒体网络和功能的异常以及肌节的破坏。
图1 cTnTK185E-CMs中的线粒体断裂和功能障碍。
3、线粒体动态失衡是 cTnT（p.K185E）诱导的形态和呼吸异常的基础
Western blot分析探究了线粒体动力学相关蛋白的表达谱。结果显示，DRP1和MFF的磷酸化水平升高，而融合相关蛋白如MFN1、MFN2和OPA1无显著变化，这说明cTnTK185E-CMs中的线粒体分裂增强（图2A和2B）。此外，Parkin蛋白水平升高和P62蛋白水平降低，说明cTnTK185E-CMs中的自噬被激活（图2A和2C）。此外，线粒体分裂抑制剂（Mdivi1）显著减弱了cTnT（p.K185E）诱导的线粒体断裂和代谢紊乱（图2D-2I）。总之，线粒体分裂的过度激活是cTnTK185E-CMs线粒体网络断裂和代谢紊乱的核心机制。
图2线粒体断裂归因于cTnTK185E-CMs中的过度线粒体分裂。
4、cTnT（p.K185E）序列变异破坏了cTnT与肌节和线粒体组织蛋白的相互作用
cTnT的K185位点位于原肌球蛋白和肌钙蛋白C结合结构域中（图3A和3B）。使用SWISS-MODEL的自动同源性建模得到cTnTWT和cTnTK185E的三维蛋白质模型，分析发现，序列变异位点附近cTnT蛋白从第61位的氨基酸残基ARG跨越到第209位的GLY（图3C）。这种结构破坏可能会干扰其与其他蛋白质的相互作用。随后，抗cTnT抗体富集肽的质谱分析数据表明，在p.K185E序列变异后，100种蛋白质与cTnT的结合亲和力降低，21种蛋白质与cTnT结合亲和力增加（图3D）。此外，还发现与cTnT和cTnT（p.K185E）变体蛋白具有不同亲和力的蛋白质主要定位于线粒体、细胞骨架和肌节（图3E），证实了由cTnT（p.K185E）序列变异介导的肌节和线粒体之间的通讯受损是DCM发病机制的主要催化剂。GO分析表明，一些与cTnT（p.K185E）变体蛋白的结合亲和力降低的蛋白质在肌动蛋白-肌球蛋白丝滑动过程中起关键作用。此外，与cTnT变异蛋白亲和力降低的蛋白质参与了线粒体组织，强调了序列变异对连接肌节和线粒体的网络结构的破坏性影响（图3F）。KEGG分析表明，这些失调的蛋白质相互作用与心脏收缩和氧化磷酸化有关，导致DCM（图3G）。热图显示，TPM1、TnC、cTnI和TTN，在肌节结构组装和心脏收缩中起着不可或缺的作用；而NADH-泛醌氧化还原酶、线粒体伴侣蛋白、ATP 酶和14-3-3蛋白，在线粒体组装和功能中发挥不可或缺的作用（图3H和3J）。这些数据表明，cTnT变体蛋白促进了cTnTK185E-CMs中肌节和线粒体之间的异常相互作用。
图3 与cTnT（p.K185E）变体蛋白相互作用降低的蛋白质参与肌节和线粒体组织。
5、14-3-3蛋白的异常激活介导的RAS/RAF1-p44/42信号轴改变了cTnTK185E-CMs中的线粒体裂变动力学
鉴定参与cTnT蛋白的肌节-线粒体通讯的关键介质，发现14-3-3蛋白是与cTnT和cTnT（p.K185E）差异相互作用的显著富集蛋白（图4A）。与正常对应物相比， cTnT（p.K185E）变体与143-3-3家族蛋白之间相互作用明显减少。选择14-3-3zeta作为代表，共免疫沉淀证实了cTnTWT-CMs中cTnT和14-3-3-3zeda之间的相互作用明显受到cTnT中p.K185E的序列变异的干扰（图4B和4C）。免疫荧光染色显示，在cTnTWT-CMs和cTnTCor-CMs组中，14-3-3zeta蛋白主要定位在肌节周围；相反，在cTnTK185E-CMs组中，14-3-3zeta蛋白明显积聚在细胞质中（图4D）。PLA结果显示进一步证实了14-3-3zeta与cTnT（P.K185E）变体蛋白之间的弱关联（图4E和4F）。14-3-3蛋白在RAS介导的RAF1激活中充当关键辅因子（图4G），确保该蛋白为ATP结合和磷酸化做好准备。KEGG分析揭示了RAS信号通路的显著差异（图4H）。RAS下游的关键信号分子RAF1蛋白激酶，在激活MAPK通路中起关键作用。Western blot结果显示，cTnTK185E-CMs中MAPK家族成员细胞外信号调节蛋白激酶（p44/42）的磷酸化显著增加（图4I和4J）。p44/42的抑制可以减轻cTnTK185E-CMs中DRP1和MFF磷酸化水平的升高，线粒体断裂和代谢紊乱（图4K至4R）。因此，cTnT（p.K185E）通过14-3-3蛋白介导的RAS/RAF1p44/42信号传导促进线粒体过度分裂。
图4 cTnT（p.K185E）变异蛋白通过14-3-3蛋白介导的RAS/RAF1-p44/42信号轴调控线粒体过度分裂。
6、抑制14-3-3蛋白介导的RAS/RAF1-444/42信号传导缓解与DCM相关的线粒体功能障碍
接下来，使用选择性14-3-3拮抗剂R18，以探究抑制RAS通路是否可以缓解cTnTK185E-CMs中的线粒体断裂。R18导致cTnTK185E-CMs中p44/42，以及DRP1和MFF的磷酸化水平显著降低（图5A和5B）；有效地挽救了cTnTK185E-CMs中的线粒体断裂表型，恢复了更融合和网状的线粒体网络（图5C和5D）。此外， R18挽救了cTnTK185E-CMs中的线粒体去极化和氧化磷酸化（图5E至5J）。总之，靶向14-3-3蛋白介导的RAS/RAF1-p44/42信号传导具有作为缓解DCM相关线粒体功能障碍的治疗策略的潜力。
图5 抑制14-3-3蛋白介导的RAS/RAF 1-p44/42信号传导轴可改善DCM相关的线粒体功能障碍
7、cTnT（p.K185E）iPSC来源的 COs的病理代谢、钙处理和纤维化反应
研究人员设计了iPSC衍生的COs，以全面评估其代谢能力、收缩功能和器官样水平的纤维化进展。cTnTK185E-COs的基础、最大和备用呼吸显著减少，表明类器官模型中的线粒体功能和氧化磷酸化受损。选择性14-3-3蛋白拮抗剂R18缓解了cTnTK185E-COs中的线粒体氧化磷酸化缺陷，挽救了cTnTK185E-Cos中的收缩幅度降低的损伤（图6A至6J）。这进一步强调了线粒体代谢减少对钙处理和收缩功能的影响。Masson三色染色结果显示，cTnTK185E-Cos的纤维化程度升高（图6K和6L）。cTnTK185E-COs中心脏损伤标志物（ANP和BNP）和纤维化标志物（ACTA2、COL1A1和COL3A1）的mRNA表达水平显著上调，而R18并没有减少cTnTK185E-COs的纤维化（图6M），这表明14-3-3蛋白可能在纤维化过程中不起关键作用。总之，这些数据验证了cTnTK185E-COs中异常线粒体代谢和心力衰竭症状的病理表现，在器官样水平上概括了DCM的关键特征；选择性14-3-3拮抗剂R18能够部分挽救这些功能障碍。
图6 .cTnTK185E衍生的COs中的病理代谢、钙处理和纤维化反应。
8、致病性cTnT（p.K185E）序列变异导致小鼠模型中DCM表型
小鼠Tnnt2基因中引入p.K192E序列变异等同于人类TNNT2基因的p.K185E序列变异（图7A）.超声心动图结果显示，12周龄cTnTK192E/+小鼠的心率与cTnTWT对照组的心率相当（图7B）.然而，cTnTK192E/+小鼠表现出心脏收缩性受损，射血分数和缩短分数显著降低，左心室壁和隔膜厚度减少，舒张末期和收缩末期的左心室内径以及左心室舒张末期容积和收缩末期容积显著增加（图7C）。与cTnTWT对照组相比，cTnTK192E/+杂合变异小鼠的肌节明显紊乱（图7D和7E）。cTnTK192E/+小鼠的心脏组织表现出严重紊乱的肌节结构，失去了规则的肌原纤维定位。此外，线粒体显示出明显的形态异常，表现为球形结构，异常聚集在整个细胞质中（图7F和7G）。进一步使用PLA证实了cTnT中的p.K192E序列变异破坏了小鼠心脏中cTnT和14-3-3zeta之间的相互作用（图7H和7I）。这些数据支持了cTnT序列变异诱导人类和小鼠DCM的保守机制。Western blot分析显示，cTnTK192E/+小鼠的p44/42、DRP1和MEF磷酸化水平升高（图7J和7K）。与对照组相比，cTnTK192E/+小鼠心肌细胞的基础和最大耗氧量以及备用呼吸能力均显著降低（图7L至7O）。此外，cTnTK192E/+小鼠心脏组织中线粒体呼吸链复合物I和II的基因表达显著降低（图7P）。这些结果表明，线粒体裂变动力学失调是cTnTK192E/+小鼠DCM发病机制的潜在驱动因素，其中过度的裂变活性可能会破坏细胞器稳态并导致心肌功能下降。TnTK192E/+小鼠通过腹腔注射线粒体分裂抑制剂Mdivi-1进行治疗，超声心动图分析显示，Mdivi-1显著改善了cTnTK192E/+小鼠的心脏功能（图7Q和7R）。
图7 致病性cTnT（p.K185E）序列变异导致小鼠模型中扩张型心肌病表型。
研究强调了cTnT（p.K185E）序列变异如何损害肌节-线粒体相互作用，为DCM的分子发病机制提供了新的见解，并为靶向治疗策略的发展提供了信息。
参考文献
Ye L, Liu J, Lei W, Ni B, Han X, Zhang Y, Wang Y, Hao K, Peng Y, Wu H, Yu M, Li H, Zhao ZA, Shen Z, Zhang J, Hu S. Disruption of cTnT-Mediated Sarcomere-Mitochondrial Communication Results in Dilated Cardiomyopathy. Circulation. 2025 May 27. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.125.071523. Epub ahead of print. PMID: 40421531.