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在科研“内卷”的今天，追热点已成常态，但当一个方向挤满人时，如何才能脱颖而出？也许答案不是挖得更深，而是看得更远。如果将两个顶流热点——例如“脂质代谢”与“铁死亡”——巧妙地交织在一起，再用机器学习的方法打通其间的壁垒，会产生怎样惊人的化学反应？今天，我们就来拆解一篇刚刚出炉的高分研究，看作者如何通过这种“升维打击”的思路，将两大热点融合成一个全新的预后模型，为我们提供了极具启发性的解题范式。
3.1. 基于 LMF 相关基因在 HR+ 乳腺癌中的分子聚类
在本研究中，作者识别出与脂质代谢和铁死亡相关指数（LMF）相关的 422 个差异表达基因（DEGs）（ Figure S1 A 和 Table S3 ）。单变量 Cox 回归分析进一步揭示 13 个 DEG 与 HR+乳腺癌的预后显著相关（P < 0.01， Figure S1 B）。相关性热图分析和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示 TNFSF4、TP63、CD24、ESR1 和 PRLR 之间存在强关联，提示它们在 HR+乳腺癌进展中可能发挥潜在作用（ Figure S1 C-D）。为分类分子簇，作者进行了无监督聚类分析，将患者分为两个不同的分子簇：簇 1（n=396）和簇 2（n=339）（ 图 2 A 和 Figure S2 A）。PCA 和 tSNE 显示簇 1 和簇 2 之间存在明显分离，证实了基于 ConsensusClusterPlus 分析的分子分类的鲁棒性和稳定性（ 图 2 B 和 Figure S2 B）。Kaplan-Meier 生存分析显示，与簇 1 患者相比，簇 2 患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）显著更长（均 P < 0.001， 图 2 C 和 Figure S2 C）。此外，基因表达谱的热图突出了两个分子簇之间表达模式的显著差异（ 图 10D）。总之，这些发现表明，基于与脂质代谢相关的基因表达，HR+乳腺癌可分为两个不同的分子簇，其中簇 2 比簇 1 具有更好的预后。
HR+乳腺癌中与脂质代谢相关的基因分子簇。（A） 无监督聚类分析的共识矩阵。(B) 主成分分析（PCA）图显示两个鉴定分子簇的明显分离。(C) 比较两个分子簇总生存期（OS）的 Kaplan-Meier 生存曲线。(D) 热图展示两个分子簇中基因表达谱和临床病理特征的差异。***P < 0.001。
3.2. 两个与脂质代谢相关的分子簇之间的生物学功能差异
为阐明两种分子簇之间预后差异的生物学机制，作者首先评估了簇 1 和簇 2 的 TMB 水平。结果表明，簇 1 患者的 TMB 显著高于簇 2 患者（ Figure S3 A）。突变分析显示，CDH1、MYH9 和 UBR5 等基因在簇 1 中表现出更高的突变频率，而 GATA3、CSMD2 和 TG 在簇 2 中具有更高的突变率（ Figure S3 B）。为进一步探索两种分子簇的功能差异，差异基因表达分析鉴定出 1102 个差异表达基因（调整后 P < 0.05， Table S4 ）。GO 富集分析显示，这些差异表达基因显著参与免疫反应分子介体生成、T 细胞受体复合物、受体配体活性和细胞因子活性（ Figure S3 C）。 KEGG 通路分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-AKT 信号通路和 NF-κB 信号通路富集（ Figure S3 D），这表明这两种分子簇之间的免疫微环境可能存在潜在差异。
为进一步评估肿瘤微环境（TME）组成的差异，应用 ESTIMATE 算法基于基因表达数据评估免疫和基质成分。分析显示，与簇 2 患者相比，簇 1 患者的基质评分、免疫评分和 ESTIMATE 评分均显著较低（ 图 3 A），表明簇 1 肿瘤纯度更高，而簇 2 肿瘤免疫细胞浸润更显著。此外，免疫检查点表达分析显示，与簇 1 相比，簇 2 中 PD-1、PD-L1 和 CTLA-4 的表达水平显著升高（ 图 3 B-D）。此外，与簇 2 患者相比，簇 1 患者中 PI3K、AKT、mTOR、ER 和 Ki-67 的表达水平显著更高，提示簇 1 中增殖信号更活跃（ Figures S3 E-I）。为更深入地描述免疫浸润模式，采用了多种方法。热图分析显示，簇 2 肿瘤的免疫细胞浸润程度显著高于簇 1 肿瘤（ 图 3 E）。这一发现得到了 H&E 染色的证实，结果显示与簇 1 相比，簇 2 肿瘤组织中淋巴细胞浸润增加（ 图 4F）。
HR+乳腺癌中 LMF 相关分子簇的生物学功能分析。(A) 使用 ESTIMATE 算法分析两组簇之间的基质评分、免疫评分和 ESTIMATE 评分。比较显示肿瘤微环境（TME）组成存在差异。(B-D) 两组分子簇之间免疫检查点分子 PD-1、PD-L1 和 CTLA4 的差异表达分析。表达变化提示免疫逃逸机制和免疫治疗反应可能存在差异。(E) 基于多种算法比较两组分子簇的免疫细胞浸润分析，提供免疫细胞浸润模式的全面概述。(F) 不同分子簇之间苏木精和伊红（H&E）染色的比较，显示簇 2 中淋巴细胞浸润更多。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001。
综合来看，这些发现表明，在集群 1 中的 HR+乳腺癌患者表现出更高的肿瘤纯度、更侵袭性的恶性特征和更低的免疫浸润，而集群 2 中的患者则显示出更显著的免疫细胞浸润和上调的免疫检查点表达，这可能有助于相对更好的预后。
3.3. LMF_index 的构建与验证及与现有指数的比较
鉴于基于 LMF 相关基因观察到的两种分子簇之间存在显著预后差异，作者致力于为 HR+乳腺癌开发一个稳健的预后指数（LMF_index）。为此，作者对两个簇间识别出的 1,102 个差异表达基因（DEGs）进行了单变量 Cox 回归分析，最终筛选出 55 个与预后显著相关的基因（ Table S5 ）。为评估 LMF_index 的稳健性，HR+乳腺癌队列（n = 735）被随机分为训练队列（n = 515， Table S7 ）和测试队列（n = 220， Table S8 ），比例分别为 7:3。训练队列用于构建 LMF_index。随后，通过 LASSO 回归分析防止过拟合，使用最优的 λ 值，将基因面板精简为 14 个基因（ Figure S4 A-B 和 Table S6 ）。通过多变量 Cox 回归分析进一步精炼，确定了七个关键基因：KRT5、CD209、KLRB1、MRC1、UGT2B4、FABP7 和 BIRC3（ 图 4 A）。基于这些基因的表达水平及其对应的回归系数构建了 LMF_index，公式如下：LMF_index = (-0.23034 × KRT5) + (0.66262 × CD209) + (-0.63397 × KLRB1) + (0.49821 × MRC1) + (0.17847 × UGT2B4) + (-0.33535 × FABP7) + (-0.28564 × BIRC3)。随后根据中位数 LMF_index 将患者分为 LMF_index 高组和 LMF_index 低组。在训练队列中，风险指数与生存状态的散点图显示，LMF_index 高的患者死亡率更高（ 图 4 B）。进一步分析表明，LMF_index 高的患者主要来自簇 1，其 LMF_index 显著高于簇 2 的患者（ 图 4 C 和 Figure S4 C）。Kaplan-Meier 生存分析显示，LMF_index 高的患者总生存期（OS）显著短于 LMF_index 低的患者（P < 0.001， 图 4 D）。这些发现在内部验证队列（内部验证队列 1 和 2）和外部验证队列（外部验证队列 1、2 和 3）中均得到了一致验证，其中 LMF_index 高值患者表现出显著更差的总体生存期（OS）结果（ 图 4 E-I）。在外部验证队列 4 中，LMF_index 高值患者除了 OS 较低外，还表现出更差的复发无生存期（RFS）（ Figure S4 D）。
构建和验证 LMF_index 并与现有指数进行比较。(A) 多变量 Cox 回归分析确定的 LMF_index 面板基因及其相应的回归系数。(B) LMF_index 分布和生存状态散点图。(C) 描述分子簇、LMF_index 和生存状态之间关系的桑基图，提供患者分类和结果的直观概览。(D-I) TCGA 训练队列、内部验证队列和外部验证队列的 Kaplan-Meier 生存曲线。(J-N) 比较 LMF_index 和现有指数在 2、5 和 8 年时的曲线下面积（AUC）值的时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线分析。(O) 不同指数的校准指数（C-index）比较，展示每个指数在预测实际结果方面的总体预测性能。
为评估 LMF_index 的预测性能，作者将其与先前建立的指标进行比较，包括铁死亡指数（Wang 等 ，Chen 等 ）和脂质代谢指数（Chang 等 ，Shen 等 ）。为确保可比性，所有分析均在 HR+乳腺癌队列中进行。Kaplan-Meier 生存分析显示，所有五个指标将患者分类为低指数组的患者表现出显著更好的总生存期（OS）（ Figure S4 E）。ROC 曲线分析表明，LMF_index 具有更优的预测准确性，其 2 年、5 年和 8 年生存的曲线下面积（AUC）值分别为 0.735、0.777 和 0.801（ 图 4 J）。虽然铁死亡指数和脂质代谢指数的 AUC 值也均高于 0.6（ 图 4 K-N），但它们始终低于 LMF_index。此外，LMF_index 的 C 指数为 0.748，优于所有其他铁死亡指数和脂质代谢指数（ 图 4 O）。此外，LMF_index 指标中的所有基因——除了 UGT2B4——都与铁死亡评分呈正相关，同时也与脂肪酸氧化和脂肪酸合成途径的活性相关（ Figure S5 ）。
为进一步验证 LMF_index 在不同临床病理亚组中的预后价值，进行了 Kaplan-Meier 生存分析。结果表明，除 N3、M1 和 IV 期亚组外，LMF_index 高值患者的总生存期（OS）显著短于低值患者（ Figure S6 ）。此外，还考察了 LMF_index 在不同临床特征中的分布情况。研究发现，70 岁以上患者的 LMF_index 显著高于 70 岁以下患者。类似地，T4 期肿瘤患者的 LMF_index 高于 T1、T2 或 T3 期患者。远处转移（M1）和 IV 期疾病患者的 LMF_index 显著高于 M0 及更早期患者（ Figure S7 ）。总之，LMF_index 能有效将 HR+乳腺癌患者分层为预后亚组，在总生存期预测方面优于现有指标，并在多个队列和临床亚组中得到了验证。
3.4. LMF_index 的独立预后分析及列线图构建
为评估 LMF_index 是否作为 HR+乳腺癌的独立预后因素，进行了单因素和多因素 Cox 回归分析，纳入了包括年龄、分期、T 分期、N 分期和 M 分期等关键临床病理变量。单因素 Cox 回归分析显示，年龄（风险比(HR) = 1.048，95%置信区间(CI) [1.029-1.067]，P < 0.001）、分期（HR = 1.694，95% CI [1.279-2.244]，P < 0.001）、M 分期（HR = 5.179，95% CI [2.662-10.076]，P < 0.001）、N 分期（HR = 1.369，95% CI [1.090-1.720]，P = 0.007）、T 分期（HR = 1.322，95% CI [1.006-1.738]，P = 0.045）和 LMF_index（HR = 1.116，95% CI [1.084-1.149]，P < 0.001）与患者预后显著相关（ 图 5 A）。多因素 Cox 回归分析进一步证实，年龄（HR = 1.054，95% CI [1.034-1.074]，P < 0.001）和 LMF_index（HR = 1.113，95% CI [1.078-1.150]，P < 0.001）是 HR+乳腺癌的独立预后因素（ 图 5 B）。
LMF_index 的独立预后分析及列线图构建。（A-B）临床病理特征和 LMF_index 的单因素和多因素 Cox 回归分析。(C)包含 LMF_index 和临床病理特征的列线图构建。(D) 评估列线图预测结果的校准曲线。(E-G) 列线图、风险评分及临床病理特征对预测 2 年、5 年、8 年生存的受试者工作特征（ROC）曲线分析。
为提高生存预测的准确性，通过整合年龄和 LMF_index 构建了列线图。校准曲线分析显示其具有强大的预测性能，列线图的 C 指数为 0.797（95% CI [0.741-0.853]），表明预测结果与实际生存结果高度一致（ 图 0C-D）。此外，多变量 ROC 曲线分析显示，列线图在 2 年、5 年和 8 年生存预测中表现出最高的 AUC 值，分别为 0.763、0.787 和 0.821，证明其相较于单个预后因素具有更优越的预测能力（ 图 1E-G）。总之，LMF_index 被确定为 HR+乳腺癌的独立预后因素。将其整合到列线图中显著提高了生存预测的准确性，为个体化预后评估提供了有价值的工具。
3.5. 上海队列中 LMF_index 的验证和组织微阵列分析
为进一步评估 LMF_index 的稳定性和预后准确性，使用上海队列进行了外部验证，该队列包括 482 名接受内分泌治疗的 HR+乳腺癌患者。基于最佳截断值，患者被分为高 LMF_index 组和低 LMF_index 组。Kaplan-Meier 生存分析表明，与低 LMF_index 组相比，高 LMF_index 组患者的总生存期（OS）显著更差（ 图 6 A）。此外，ROC 曲线分析显示，8 年 OS 预测的 AUC 值超过 0.6，进一步证实了 LMF_index 在 HR+乳腺癌中的预测可靠性（ 图 6 B）。此外，单因素和多因素 Cox 回归分析将 LMF_index 确立为 HR+乳腺癌患者的独立预后因素（ 图 6 C-D），突出了其在预后评估中的临床相关性。
上海队列中 LMF_index 预后价值的验证。(A) 使用最佳截断值比较 LMF_index 低分组和高分组的 Kaplan-Meier 生存分析。(B) 上海队列中 LMF_index 在 6、7 和 8 年的时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线。(C-D) 上海队列中 LMF_index 与临床病理因素结合的单因素和多因素 Cox 回归分析。
为进一步验证 LMF_index 的预后意义，对乳腺癌组织微阵列进行 mIHC 染色，以评估 KRT5、UGT2B4、BIRC3、MRC1、CD209、FABP7 和 KLRB1 的表达水平。本研究使用的组织微阵列包含 136 例乳腺癌患者的样本。然而，在多次染色实验中，发现五个组织点存在脱落问题。因此，后续分析中共纳入 131 例乳腺癌患者。LMF_index 基于七个蛋白标志物的阳性染色细胞比例进行计算。代表性 mIHC 图像显示了高、低 LMF_index 组之间的表达差异明显（ 图 0A-B）。Kaplan-Meier 生存分析进一步表明，LMF_index 低的患者预后更佳（ 图 1C）。此外，ROC 曲线分析显示，LMF_index 在 8 年总生存期预测中达到了 0.76 的 AUC 值，突显了其作为可靠预后生物标志物的潜力（ 图 2D）。值得注意的是，LMF_index 与患者年龄和生存状态显著相关（ 图 3E），这进一步支持了其作为预后指标的临床相关性。总之，本研究在转录组水平上于独立的上海队列中验证了 LMF_index，并在乳腺癌组织微阵列中于蛋白水平上验证了其有效性，证实了其作为 HR+乳腺癌预后生物标志物的可靠性。
LMF_index 在乳腺癌组织微阵列中的预后价值。(A) 基于多重免疫组化（mIHC）染色的 KRT5、UGT2B4、BIRC3、MRC1、CD209、FABP7 和 KLRB1 在 LMF_index 低组的代表性图像。(B) 基于 mIHC 染色的 KRT5、UGT2B4、BIRC3、MRC1、CD209、FABP7 和 KLRB1 在 LMF_index 高组的代表性图像。(C) 使用最佳截断值比较 LMF_index 低组和高组的 Kaplan-Meier 总生存期（OS）分析。(D)LMF_index 的 2 年、5 年和 8 年 OS 的时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线。(E) 展示 LMF_index 低组和高组不同临床因素分布的环图。
为进一步研究 LMF_index 面板基因在乳腺癌中的表达特征，作者首先使用 UALCAN 数据库分析了这些基因在正常乳腺组织和 HR+乳腺癌组织中的表达水平。结果表明，KRT5、UGT2B4、MRC1、CD209 和 KLRB1 在 HR+乳腺癌中较正常乳腺组织显著下调，而 BIRC3 和 FABP7 在两组间的表达无显著差异（ Figure S8 ）。为阐明这些基因在不同细胞类型中的分布，作者分析了 GSE148673 数据集的 scRNA-seq 数据。UMAP 聚类将细胞分为 28 个亚群，随后注释为 9 种主要细胞类型（ 图 8 A-C）。单细胞表达分析显示，KRT5 和 FABP7 在肿瘤细胞中高度富集，UGT2B4 主要表达于上皮细胞，BIRC3 和 KLRB1 富集于 CD8+ T 细胞，而 MRC1 和 CD209 在单核细胞/巨噬细胞中高度表达（ 图 8 D-J 和 Figure S9 ）。这些发现描绘了 LMF_index 面板基因在肿瘤细胞和免疫细胞中的不同表达模式，为它们在肿瘤进展和免疫调节中的潜在功能作用提供了宝贵的见解。
LMF_index 面板基因的单细胞转录组表达水平分析。(A) 使用 TISCH2 数据库中的统一流形近似和投影（UMAP）方法对乳腺癌组织进行降维和聚类。(B) 将 28 个簇注释为 9 种不同的细胞类型。(C) 显示每种细胞类型中标记基因表达水平的点图。(D-J) 在各种免疫细胞和肿瘤细胞类型中分析 LMF_index 面板基因（KRT5、UGT2B4、BIRC3、MRC1、CD209、FABP7 和 KLRB1）的单细胞表达水平。
近期研究表明，铁死亡过程中释放的细胞碎片和脂质代谢物可以通过激活抗原呈递细胞和促进 T 细胞活化来增强肿瘤特异性免疫反应27 。为了进一步探索 LMF_index 作为独立预后因子的作用机制，作者研究了 TCGA 队列中 HR+乳腺癌样本中 LMF_index、铁死亡和免疫细胞浸润之间的关系。相关性分析显示，LMF_index 与铁死亡评分和免疫浸润评分均呈负相关，而铁死亡评分和免疫浸润评分则呈正相关（ Figure S10 A-C）。这些结果表明，LMF_index 较低的患者预后改善可能至少部分归因于增强的铁死亡活性和更显著的免疫细胞浸润。ACSL4 已被认为是铁死亡敏感性的关键决定因素，与 CD8+ T 细胞浸润增加和免疫检查点抑制剂（ICIs）疗效改善相关 49 。 相反，GPX4 通过解毒脂质过氧化物来抑制铁死亡 50 。为了进一步探索它们的空间分布，作者采用 PanCK 染色来区分组织微阵列中的上皮和基质区域，并对 PanCK、CD8、ACSL4 和 GPX4 进行了 mIHC 检测( Figure S10 D-E)。结果显示，ACSL4+细胞的分布在上皮和基质区域之间没有显著差异，而 GPX4+细胞在上皮区显著更多( Figure S10 F)。值得注意的是，与高 LMF_index 组相比，低 LMF_index 组的 ACSL4+细胞密度显著更高，而 GPX4+细胞的分布在两组之间没有显著差异( Figure S10 G)。进一步的相关性分析显示，ACSL4+细胞与 CD8+ T 细胞浸润呈正相关，而 GPX4+细胞没有观察到这种相关性( Figure S10 H-I)。这些数据表明，低 LMF_index 组的患者表现出更高的 ACSL4 表达，表明铁死亡敏感性增加，这可能有助于更多的 CD8+ T 细胞浸润和增强抗肿瘤免疫。
接下来，多种算法分析显示，LMF_index 与巨噬细胞浸润呈正相关，而与 CD8+ T 细胞、B 细胞和自然杀伤（NK）细胞的浸润呈负相关（ Figure S11 A）。鉴于 LMF_index 与免疫细胞浸润之间的关联，作者进一步探索了 HR+乳腺癌患者中 LMF_index 高组和 LMF_index 低组之间免疫微环境的差异。ESTIMATE 分析显示，与 LMF_index 高组相比，LMF_index 低组患者的基质评分、免疫评分和总 ESTIMATE 评分均较高，提示 LMF_index 低组中免疫细胞浸润更活跃，肿瘤纯度更低（ Figure S11 B）。具体而言，与 LMF_index 高组相比，LMF_index 低组患者显示出幼稚 B 细胞、记忆 B 细胞、浆细胞、CD8+ T 细胞、静息记忆 CD4+ T 细胞、滤泡辅助性 T 细胞、单核细胞、M1 巨噬细胞、静息树突状细胞（DCs）和中性粒细胞浸润增加。 相反，LMF_index 高患者表现出静止 NK 细胞、M0 巨噬细胞和 M2 巨噬细胞的浸润率更高，表明其 TME 免疫抑制性更强（ Figure S11 C）。此外，ssGSEA 分析证实，LMF_index 低患者不仅表现出更高的免疫细胞浸润，还表现出增强的免疫相关功能活动，包括趋化因子受体信号通路、免疫检查点信号通路、人类白细胞抗原（HLA）信号通路和 II 型干扰素反应（ Figure S11 D）。此外，乳腺癌组织微阵列的 mIHC 分析证实，与 LMF_index 高组相比，LMF_index 低组的 CD8+ T 细胞、CD68+（M0 样）巨噬细胞和 CD68+CD163-（M1 样）巨噬细胞浸润水平显著更高。相比之下，两组间 CD68+CD163+（M2 样）巨噬细胞浸润水平无统计学显著差异（ 图 9 A-E）。
不同 LMF_index 组中的免疫细胞浸润和免疫治疗敏感性分析。(A) 显示 LMF_index 低和高组中 CD8、CD68、CD163 和 PD-L1 表达的代表性多重免疫组化（mIHC）图像。(B-F) 免疫细胞浸润的定量分析，比较 LMF_index 低和高组中 CD8+ T 细胞、CD68+（M0 样）巨噬细胞、CD68+CD163-（M1 样）巨噬细胞、CD68+CD163+（M2 样）巨噬细胞和 PD-L1+细胞。(G-J) 比较 LMF_index 低和高组中的免疫表型评分（IPS）。(K) 比较 GSE173839 数据集中接受新辅助免疫治疗的 LMF_index 低和高患者的病理完全缓解（pCR）率。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。
抗肿瘤疗法在乳腺癌中的疗效受肿瘤微环境（TME）的显著影响，TME 在决定患者预后和治疗反应中起着关键作用，尤其是在免疫疗法中51 52 。鉴于 LMF_index 反映了 TME 中免疫细胞浸润的水平，作者进一步研究了其在预测 HR+乳腺癌免疫疗法反应中的作用。作者首先分析了其与 HR+乳腺癌免疫检查点表达的关联。如图 Figure S11 E 所示，LMF_index 与 HR+乳腺癌中多种免疫检查点的表达水平相关。亚组分析显示，LMF_index 低表达患者的 PD-1、PD-L1 和 CTLA4 表达显著高于 LMF_index 高表达患者（ Figure S11 F-H），表明 LMF_index 低表达肿瘤可能对免疫检查点抑制剂（ICIs）更敏感。此外，组织微阵列的 mIHC 分析证实，LMF_index 低表达组的 PD-L1 表达水平显著高于 LMF_index 高表达组（ 图 9 A, F）。进一步使用基于生物标志物的评分系统 IPS（预测肿瘤对免疫检查点抑制剂响应的评分系统）进行了验证，IPS 评分越高表明免疫治疗响应越好 53 。作者的研究结果表明，LMF_index 低分患者比 LMF_index 高分患者的 IPS 评分显著更高（ 图 9 G-J），这进一步证实了 LMF_index 低分肿瘤更有可能从免疫检查点抑制剂治疗中获益。此外，还分析了 I-SPY2 临床试验的数据，以评估现实世界中新辅助免疫治疗的响应情况。LMF_index 低分的 HR+乳腺癌患者在接受了新辅助免疫治疗后，其病理完全缓解率显著高于 LMF_index 高分患者（P < 0.05， 图 9 K），这进一步突出了 LMF_index 在指导免疫治疗选择方面的潜在临床应用价值。 总之，LMF_index 与肿瘤免疫微环境密切相关，LMF_index 低的患者表现出更高的免疫浸润、增加的免疫检查点表达以及更大的免疫检查点抑制剂应答性，这一点通过 IPS 分析和 I-SPY2 试验的新辅助免疫治疗结果得到了证实。
3.8. KLRB1 表达与免疫细胞浸润相关，可能作为免疫治疗反应的生物标志物
对 LMF_index 面板基因的单细胞表达分析显示，BIRC3 和 KLRB1 主要富集在 T 细胞中。正常乳腺组织与 HR+乳腺癌组织之间的差异表达分析表明，肿瘤组织中 KLRB1 表达显著降低，而 BIRC3 表达无显著差异。此外，单因素 Cox 回归分析确定 KLRB1 为保护性因素（HR < 1，P < 0.05），其表达与LMF_index呈负相关（R = -0.432，P < 0.001）（Figure S12 A）。配对的乳腺癌组织分析证实，肿瘤中KLRB1表达显著低于邻近正常组织（ Figure S12 B）。mIHC结果显示，KLRB1表达高的患者预后更好，PD-L1表达水平也更高（表 1 ）。Kaplan-Meier Plotter数据库的生存分析进一步表明，KLRB1表达越高，HR+乳腺癌患者的总生存期（OS）和无病生存期（RFS）显著更好（ Figure S12 C）。
为探究 KLRB1 在肿瘤免疫微环境中的作用，作者考察了其与免疫细胞浸润的相关性。热图分析显示 KLRB1 表达与多种免疫细胞群体（包括 T 细胞、B 细胞和巨噬细胞）呈正相关（ Figure S12 D）。H&E 染色进一步验证了 KLRB1 表达高的乳腺癌组织中淋巴细胞浸润增加（ Figure S12 E）。为更深入评估 KLRB1 表达与免疫细胞浸润的关系，作者在乳腺癌组织微阵列上进行了 mIHC 染色，靶向 PanCK、KLRB1、CD8、CD68、CD163 和 PD-L1。代表性图像在图 10 A 和 Figure S12 F 中展示了低表达和高表达 KLRB1 患者的免疫浸润模式差异。基于标记阳性细胞比例对蛋白表达水平进行定量，并据此进行生存分析。结果表明，KLRB1 阳性细胞比例较高的患者预后显著更好（ 图 10 B）。同样地，CD8+ T 细胞比例较高（ 图 5C）和 CD68+CD163-巨噬细胞比例较高（ 图 6E）与改善的生存结果相关。相反，CD68+细胞和 CD68+CD163+巨噬细胞与预后无显著相关性（ 图 7D、F）。相关性分析进一步显示 KLRB1+细胞与 CD8+ T 细胞、CD68+巨噬细胞、CD68+CD163-巨噬细胞和 PD-L1+细胞呈正相关（ 图 8G）。亚组分析表明，高 KLRB1 表达患者的 CD8+ T 细胞、M0 巨噬细胞和 M1 巨噬细胞浸润水平显著高于低 KLRB1 表达患者（ 图 9H-J）。然而，两组间的 M2 巨噬细胞浸润水平无显著差异（ 图 10K）。此外，基于 PanCK 表达的时空分析显示，KLRB1 表达在基质区显著高于上皮区，提示其主要存在于免疫细胞中（ 图 11L）。值得注意的是，Kaplan-Meier Plotter 数据库中接受免疫治疗的患者的 Kaplan-Meier 生存分析显示，高 KLRB1 表达与接受 PD-1、PD-L1 或 CTLA-4 阻断治疗的患者的延长总生存期（OS）相关（ 图 12M-O）。这些发现突显了 KLRB1 作为免疫微环境关键调节者的作用，表明其与 CD8+ T 细胞和 M1 巨噬细胞浸润密切相关。此外，KLRB1 可能作为潜在的预后生物标志物和免疫治疗反应预测因子，为优化免疫治疗策略提供新的见解。
乳腺癌组织微阵列中 KLRB1 表达和免疫细胞浸润分析。（A）显示 KLRB1 高表达组中 PanCK、CD8、KLRB1、PD-L1、CD68 和 CD163 表达的代表性多重免疫组化（mIHC）图像。（B-F）比较 KLRB1+细胞、CD8+ T 细胞、CD68+（M0 样）巨噬细胞、CD68+CD163-（M1 样）巨噬细胞和 CD68+CD163+（M2 样）巨噬细胞的浸润水平的 Kaplan-Meier 总生存期（OS）分析。（G）KLRB1+细胞、CD8+ T 细胞、CD68+（M0 样）巨噬细胞、CD68+CD163-（M1 样）巨噬细胞和 CD68+CD163+（M2 样）巨噬细胞的百分比与 PD-L1+细胞的相关性热图分析。（H-K）KLRB1+细胞高表达和低表达乳腺癌患者中 CD8+ T 细胞、CD68+（M0 样）巨噬细胞、CD68+CD163-（M1 样）巨噬细胞和 CD68+CD163+（M2 样）巨噬细胞的浸润水平差异分析。（L）基质和上皮区域 KLRB1+细胞的差异分析。(M-O) 基于 KLRB1 表达水平，对接受 PD-1 抑制剂、PD-L1 抑制剂和 CTLA4 抑制剂治疗的患者的 Kaplan-Meier 总生存期分析。
总结
总之，本研究在 HR+乳腺癌中鉴定出不同的 LMF 相关分子簇，每个簇表现出独特的预后和免疫特征。此外，LMF_index 代表了一种有前景的 HR+乳腺癌预后和预测生物标志物，为免疫治疗分层提供潜在指导。然而，通过功能研究和前瞻性临床试验进行进一步验证，对于确立其更广泛临床适用性至关重要 。
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