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3.1. KIRC 患者 AICD 基因的变异景观
研究设计的示意概述见图 1。总体而言，KIRC 与 TCGA 数据库中的正常标本共识别出 228 个 DEARGs（ 图 2A）。集成数据集中 228 个 DEARG 的表达水平见图 2B。随后，通过 Metascape 建立了 PPI 网络，并通过 MCODE 插件分析了网络中的关键模块。如图 2C 和 D 所示，识别出十个重要模块。此外，评估了 KIRC 中 AICD 相关 DEARGs 的分子变异景观，其中错义突变是最常见的变异类型，如图 2E 所示。其中，ANK3 基因表现出最高的突变频率。CNV 突变分析揭示了最具显著 CNV 变化的前 20 个 DEARGs（ 见图 2F）。Go 和 KEGG 富集分析表明，DEARGs 主要参与羧酸代谢、HIF-1 信号通路、氧化还原酶活性、对外种生物刺激的反应、缺氧反应、细胞稳态和碳代谢等过程（ 图 2G，H ）。
KIRC 患者 AICD 基因的变异景观及功能特征分析。（A） 火山图，显示 KIRC 中差异表达的 AICD 相关基因（DEARGs）（绿色：下调 DEARGS;黄色：上调 DEARGS;灰色：未变基因），FDR<0.5，|log2FC|>1。（B）PCA 显示 KIRC 与正常样本之间存在明显差异。（C） 基于 Metascape 数据库构建的 AICD 相关 DEARGS 的 PPI 网络。（D） 通过 MCODE 算法识别重要子网络。（E）TCGA 队列中排名前 20 的 AICD 相关 DEARG 项目。（F） 在前 20 个 AICD 相关 DEARGS 中的 CNV 损失率、收益率及无 CNV 率。（G，H）AICD 相关 DEARGS 的功能富集分析。
3.2. 空间和单细胞转录组学中的免疫原性 AICD 特征
作者采用 SCTransform 方法调整空间测序深度的变化，随后进行归一化程序，最终通过降维和聚类识别出 11 种不同的细胞类型（见图 3A）。为评估 AICD 相关 DEARGs 在每个细胞亚组中的作用，作者利用 AUCell R 软件包评估各亚组内的 AICD 活性（见图 3B）。随后，进行了斯皮尔曼相关分析，以考察细胞含量与 AICD 活性在所有空间点的关系（见图 3C）。作者从 3 名 ccRCC 患者中提取的 49,899 个细胞中收集了 scRNA-seq 数据。为了消除批量效应，作者采用了 Harmony 软件包，成功整合了三个采样。随后，基于前 2000 个最具变异基因，使用 PCA 和 UMAP 进行维度降低。细胞聚类后，生成了 26 个不同的簇，分辨率为 1.5（见图 3D）。随后，细胞根据标志基因表达被注释为 11 种主要细胞类型：B 细胞、CD4+ T 常规细胞（CD4Tconv）、CD8+ T 细胞（CD8T）、耗尽的 CD8+ T 细胞（CD8Tex）、肥大细胞、内皮细胞、树突状细胞、浆细胞、NK 细胞、单核细胞/巨噬细胞以及增殖 T 细胞（Tprolif）（图 3E).为确定 AICD 在这些细胞类型的免疫原性活性，利用 Seurat 软件包中的 ssGSEA 函数计算每个细胞 AICD 相关 DEARG 的表达分数（见图 3F）。在 11 种细胞类型中，内皮细胞表现出显著更高的 AICD 活性（见图 3G）。
空间转录组学和单细胞 RNA 测序中 AICD 活性的表征。（A） KIRC 的空间转录组学数据。（B）AICD 强度的空间可视化。（C） 对肿瘤微环境中 AICD 活动空间特征的 Spearman 相关评估。（D，E） 利用标记基因鉴定单细胞类型。（F） 与 AICD 相关的增益分数。（G） 不同细胞类型间 AICD 活性分布。
采用单变量 Cox 回归分析，识别出 TCGA-KIRC 队列中的 71 个 AICD 相关基因。通过 Kaplan-Meier 生存分析进一步评估这些基因，发现了 51 个具有显著预后价值的基因。为降低过拟合风险并优化候选生物标志物的选择，采用了三种机器学习算法来识别具有诊断意义的 KIRC 生物标志物。CoxBoost 算法识别出 14 个基因（图 4A），随机森林模型识别出 15 个基因（图 4B），LASSO 回归分析得出 8 个基因（见图 4C、D）。使用维恩图交叉这些基因，揭示了 6 个稳健的核心生物标志物：FOXM1、ANK3、ATP1A1、HADH、THRB 和 PLG（见图 4E）。随后，保留了五个基因——FOXM1、ANK3、ATP1A1、HADH 和 PLG，通过 stepAIC Cox 回归分析构建 AICD 相关预后模型（见图 4F、G）。计算每位患者的风险评分采用以下公式：RiskScore = （FOXM1 表达×0.5297） + （ANK3 表达×−0.3772） + （ATP1A1 表达×−0.4214） + （HADH 表达×−0.3560） + （PLG 表达×−0.2366）。根据中位风险评分，患者被分为 LR 组和 HR 组。生存分析显示，LR 组患者在 TCGA-KIRC（图 5A，p<0.0001）和 E-MTAB-1980（图 5B，p<0）中，其 OS 显著优于 HR 组。0001）队列。此外，评估了两组 1/3/5 年生存期的 AUC，显示风险评分在估计生存结局时具有很高的准确性（见图 5C、D）。两组队伍的风险评分和存活状态分布见图 5E、F。这些结果证实了 AICD 相关预后模型在估计 KIRC 患者预后结局方面的稳健性。此外，HPA 数据库的 IHC 分析显示核心基因的蛋白质水平与预后谱相符，验证了模型的临床相关性（见图 5G）。
开发并验证 KIRC 患者 AICD 相关预后特征。（A） 根据 CoxBoost 算法进行特征选择。（B） 利用随机森林（RF）算法识别最佳生物标志物。（C，D）LASSO-Cox 回归模型中的变量选择。（E） 维恩图，表示三种算法识别的交集部分。（F） 通过 stepAIC 回归分析选出的最终 5 个预后基因的森林图。（G） TCGA-KIRC 队列预后基因的存活分析。
验证及对 KIRC 患者 AICD 相关特征的预后表现。TCGA-KIRC（A） 和 E-MTAB-1980（B） 队列中 LR 和 HR 患者的 OS。TCGA-KIRC（C） 和 E-MTAB-1980（D） 队列中用于估计生存的预后模型的 ROC 曲线。（风险评分分布按生存状态和时间分层，涵盖 TCGA-KIRC（E） 和 E-MTAB-1980（F） 队列。（G） 通过 HPA 数据库表达肾癌和正常组织中的核心预后模型基因。
单变量/多变量 Cox 回归分析显示，相较于其他常见临床特征，风险评分是 KIRC 患者的独立预后因素（见图 6A、B）。在 TCGA-KIRC 队列中，单变量/多变量 Cox 分析均识别出风险评分 TNM。M、肿瘤状况和年龄作为独立的预后因素。TCGA-KIRC 队列中 KIRC 患者的基因表达特征、风险评分及临床因素如图 6C 所示。为评估风险模型的临床适用性，将 TNM 分期、肿瘤状态和年龄等变量整合进用于预测 TCGA-KIRC 队列 KIRC 患者的总生存率的命名图（见图 6D）。与基因特征模型相比，传记图模型显示出优异的预后表现，LR 组与 HR 组之间存在显著的预后差异（P<0.001， 见图 6E）。此外，合并模型估计 1/3/5 年 OS 的 AUC 分别为 0.873、0.833 和 0.833（见图 6F）。校准曲线进一步证实了该模型在估计 1/3/5 年开放时间上的准确性（见图 6G）。此外，决策曲线分析（DCA）证明，与所有其他评估预测变量相比，该模型的预测表现更优（见图 6H）。总体而言，开发的该命名仪展现出强大的预测力和临床适用性，为基于关键临床指标评估 KIRC 患者的预后结局提供了有效工具。
在 KIRC 患者预后预测方面的命名图开发与评估。（A，B）TCGA-KIRC 队列中单变量/多变量 Cox 临床病理特征和风险评分分析。（C） 基于 AICD 相关风险评分的临床特征和模型基因表达分布。（D） 用于预测 KIRC 患者的预后。（E） 基于计录评分比较 LR 组和 HR 组的 Kaplan-Meier 生存分析。（F） TCGA-KIRC 队列中对该组的 ROC 曲线分析。（G） 用于预测 TCGA-KIRC 中 1 年、3 年和 5 年总体生存率的校准图。（H） DCA，显示该命名图相较其他临床特征的净益处。
3.5. 免疫微环境、免疫特征与 AICD 相关预后模型之间的相关性
为了研究 ccRCC 标本中的免疫浸润景观，作者通过 CIBERSORT 算法量化了肿瘤浸润免疫细胞的丰度（图 7A）。作者的分析显示，LR 组表现出 T 滤泡辅助细胞、单核细胞、M2 巨噬细胞和活化树突状细胞的浸润率较高，而 HR 组则有较高的活化 NK 细胞、M1 巨噬细胞和浆细胞水平升高。此外，作者还发现预后模型基因与免疫细胞浸润之间存在显著相关性。具体而言，FOXM1 与 M1 巨噬细胞和激活的 CD4+记忆 T 细胞呈正相关，而 ATP1A1 与原始 B 细胞呈正相关（见图 7B）。为进一步探讨 ccRCC 患者中模型基因的表达，作者分析了 scRNA-seq 数据（GSE139555）。点阵图分析显示 ATP1A1 主要表达于内皮细胞中（图 7C）。鉴于 ICI 抑制剂（ICIs）作为免疫治疗形式的临床应用日益增加，作者考察了 LR 和 HR 队列间 IC 相关基因的表达。结果显示 LR 组 HAVCR2、CD274 和 HHLA2 表达水平显著升高，表明对 IC 抑制的敏感性差异（见图 7D）。此外，作者评估了每位 ccRCC 患者的 TIDE（肿瘤免疫功能障碍与排除）评分，观察到 HR 队列表现出显著较高的 TIDE 分数，暗示这些患者可能对免疫治疗存在耐药性（见图 7E）。这些数据表明，心率评分为 CCRCC 的患者可能从免疫治疗策略中获益较少。
基于 AICD 相关预后模型对 LR 和 HR KIRC 患者的免疫景观分析。（A） 通过 CIBERSORT 计算的 22 种浸润免疫细胞丰度图。（B）TME 浸润免疫细胞与 AICD 相关预后模型中基因之间的相关性。（C） 气泡图，显示不同细胞亚型中预后生物标志物的平均和百分比表达。（D） 展示 IC 相关基因表达水平的箱型图。（E） 跨风险组 TIDE 分数的 Violin 图。*p<0.5;**p<0.1;p<0.01;p<0.001。
3.6. 基于 AICD 预后评分的 LR 和 HR KIRC 患者的基因组变异
HR KIRC 患者在蛋白编码区的 TMB 显著高于 LR 患者（见图 8A）。在两个风险组中分析了前 20 个最常突变的基因（见图 8B）。值得注意的是，HR 组中 VHL（HR 为 56%，LR 为 45%）和 PBRM1（HR 为 46%，LR 为 39%）的突变较为常见（见图 8C）。拷贝数变异（CNV）分析显示 LR 组和 HR AICD 组之间存在明显的 CNV 模式（见图 8D），HR 组的基因组改变比例（FGA）显著更高（见图 8E）。这些突变，尤其是位于相关蛋白 DNA 结合结构域的突变，可能导致肿瘤抑制效能降低和患者生存率降低。此外，高 AICD 风险评分与微卫星不稳定性（MSI）升高相关，MSI 被认为是 IC 抑制治疗的预测标志（见图 8F）。
KIRC 中 AICD 相关预后亚组的突变景观。（A）TMB 分析。（B） 描绘 HR 组和 LR 组体细胞突变特征的瀑布图。（C） 风险组 VHL 和 PBRM1 中若干突变位点的比较。（D） 逻辑分析组和 HR 组的 CNV 模式。（E） 风险组间的 FGA 差异。（F）MSI 在不同风险评分类别中的比较。
3.7. ATP1A1 的敲低促进肾细胞癌细胞的增殖、迁移和侵入
肿瘤免疫微环境分析显示，ATP1A1 表达与内皮细胞和原始 B 细胞显著相关。为探讨 ATP1A1 在肾细胞癌中的调控作用，设计了四段针对 ATP1A1 的 siRNA 序列以下调其表达。CCLE 数据显示 ，ATP1A1 在 A498 和 786-O 细胞系中表达较高（见图 9A）。后续 qRT-PCR（图 9B）和西方印迹分析（图 9C）确认有效敲低，siATP1A1#2 和 siATP1A1#4 表现出最高的沉默效率;这两条序列被选中进行进一步的功能性实验。CCK-8 检测（图 9D）显示 ATP1A1 的敲低显著增强了肾癌细胞的增殖能力。Transwell 迁移测定（图 9E）和伤口愈合检测（图 9F）进一步显示，ATP1A1 抑制显著促进细胞入侵和迁移，相较对照组。这些发现凸显了 ATP1A1 作为治疗 KIRC 靶点的潜力。
ATP1A1 基因敲低对 RCC 细胞恶性生物功能的影响。（A） 基于 CCLE 数据的 RCC 细胞系中 ATP1A1 表达。（b）siATP1A1 转染后 ATP1A1 的 mRNA 水平。（C）Western blot 分析确认了 ATP1A1 敲低在 A498 和 786-O 细胞中的效率。（D）ATP1A1 敲低后的细胞增殖。（E） ATP1A1 敲低后 A498 和 786-O 细胞穿孔侵入图像。（F）ATP1A1 敲低后 A498 和 786-O 细胞刮擦。0.1234（ns）， 0.0332（*）， 0.0021（**）， 0.0002（***）， <0.0001（****）.
3.8. Emodinanthrone 和 ATP1A1 的分子对接分析
为开始分子对接分析，作者首先利用上述方法制备了中医化合物库和蛋白质结构。随后进行了高通量虚拟筛选，以识别具有有望相互作用的化合物。基于对接得分，选出结合能最强的前 20 种化合物进行进一步分析。结合能值越小通常表示结合亲和力更强，低于-5 kcal/mol 的数值被认为有利于结合。在顶级化合物中，Emodinanthrone 展现出最佳结合能，并被选中进行详细的三维结合模式和相互作用分析。对接结果显示 Emodinanthrone 与 ATP1A1 之间结合能为-6.800 kcal/mol。值得注意的是，Emodinanthrone 与 ATP1A1 上的若干关键氨基酸相互作用，形成三条氢键，分别与 GLN-126、GLU-122 和 ASP-891 形成。这些相互作用对于稳定蛋白质-配体复合物至关重要，并且很可能在化合物的生物活性中发挥关键作用。这些相互作用的可视化分析见图 10。
ATP1A1 和 Emodinanthrone 的分子结合分析。一个详细的三维分子对接模型，展示了 ATP1A1 与 Emodinanthrone 之间的结合亲和力及相互作用。该蛋白以蓝色表示，Emodinanthrone 化合物以青色表示。关键残基以棒状表示，氨基酸与 Emodinanthrone 之间的氢键相互作用以黄色虚线表示。
利用 TCGAplot R 软件包，利用 TCGApl R 软件评估多种癌症类型中ATP1A1 的表达。结果显示，ATP1A1 在 ESCA、HNSC、LIHC、STAD 和 CHOLE 中显著过度表达，而在 COAD、KIRP、KIRC、KICH、THCA 和 LUAD 中表达明显较低（见图 11A）。蛋白质表达分析显示肿瘤组织与正常组织之间 ATP1A1 水平存在显著差异。具体而言，与正常组织相比，KIRC、GBM、LUAD 和 PAAD 肿瘤样本中的 ATP1A1 蛋白表达显著降低（见图 11B）。此外，作者考察了 ATP1A1 表达与微卫星不稳定性（MSI）之间的相关性。雷达图显示 ATP1A1 与 MSI 在 CESC、PRAD、SARC 和 TGCT 中呈正相关（见图 11C）。同样，分析 ATP1A1 表达与肿瘤突变负荷（TMB）之间的相关性，显示 SKCM 呈正相关性（见图 11D）。为探讨 ATP1A1 与免疫微环境的关系，作者研究了 ATP1A1 表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性（见图 11E）。ATP1A1 表达与大多数 TCGA 癌症中调节 T 细胞（Tregs）、滤泡辅助 T 细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ T 细胞和记忆 B 细胞的浸润呈负相关，而在多种癌症中，与巨噬细胞浸润呈正相关。此外，作者还研究了 ATP1A1 在不同癌症类型和遗传位点上的甲基化模式（见图 11F）。如图 11G 所示，ATP1A1 表达与多种化疗药物的敏感性呈正相关。最后，为评估 ATP1A1 的潜在临床相关性，单变量 Cox 回归分析确认 ATP1A1 为癌症患者 OS 的重要预后因子（见图 11H）。
ATP1A1 表达、免疫特征及遗传变异的泛癌分析。（A） TCGA 肿瘤类型及邻近正常组织的 ATP1A1 表达水平。（b）CPTAC 数据库中癌症与正常组织之间 ATP1A1 蛋白水平差异（质谱）。（C）TCGA 数据集中 ATP1A1 表达与 MSI 的相关性。（D） TCGA 数据集中 ATP1A1 表达与 TMB 的关联。（E） 热图，显示 ATP1A1 表达与各种癌症免疫细胞浸润之间的关系。（F） 泛癌中 ATP1A1 表达与免疫相关基因之间的皮尔逊相关性。（G）ATP1A1 表达与泛癌化疗药物敏感性之间的 Spearman 相关性。（H）ATP1A1 作为 TCGA 癌症预后因子的泛癌 Cox 回归分析。*p < 0.05;p < 0.001;p < 0.0001。
总结
本研究全面探讨了 AICD 相关基因在 KIRC 中的预后意义。以ATP1A1 为中心的预后模型在外部验证队列中表现出强的预测表现。在免疫微环境组成、基因组不稳定性和免疫检查点表达方面，风险组间观察到显著差异。功能性检测证实，ATP1A1 的敲低显著促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。关键的是，分子对接鉴定出天然化合物 Emodinanthrone 作为 ATP1A1 的高亲和力配体，暗示其作为靶向 KIRC 氨-免疫代谢轴的新型治疗剂潜力。此外，泛癌分析揭示了 ATP1A1 参与代谢调控、治疗靶点和免疫细胞浸润，为 KIRC 致病机制提供了机制性见解。综合而言，这些发现将 ATP1A1 确定为一种有前景的预后生物标志物和治疗靶点，为 KIRC 个性化治疗策略铺平了道路。
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