结果：
3.1. TBBPA 诱导肝损伤潜在机制的网络毒理学分析
雷达图显示，TBBPA 对肝脏、皮肤、眼睛、肺部及其他组织和细胞具有潜在的生物毒性（ 图 1A）。共有 6499 个肝损伤相关靶基因和 281 个 TBBPA 相关靶基因;交集结果为 206 个交集的目标基因（ 见图 1B）。KEGG 富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI 网络）涉及关键通路：癌症通路、MAPK 信号通路、乙型肝炎、炎症通路（PPI 网络图中的 IL-6、IL-1β）、氧化应激（PPI 网络图中的 SOD2）。（ 图 1C 和 D）GO 富集分析显示，对于生物过程（BP），这些基因主要与凋亡过程和细胞内受体信号通路的负向调控相关，等人。对于细胞成分（CC），这些基因定位于线粒体、细胞质、细胞外泌体、细胞外空间和核质等。分子功能（MF）方面，基因为核受体活性增强、蛋白质结合、酶结合和组蛋白激酶活性（ 图 1E）。这些发现表明 TBBPA 主要通过调节 MAPK 及相关通路，影响鲤鱼肝的氧化应激、增殖、分化、凋亡和炎症。
图 1。TBBPA 的网络毒理分析结果。（A） 用于 TBBPA 毒性预测的雷达图。（B） 用于筛查 TBBPA 诱导肝损伤相关基因的维恩图。（C） TBBPA 诱导肝损伤相关基因的 PPI 网络图。（D） TBBPA 诱导肝损伤相关基因的 KEGG 富集结果。（E） TBBPA 诱导肝损伤相关基因的去氧饱和环图。
肝脏切片的 H&E 和 TUNEL 染色结果见图 2A。C 组表现出排列良好的肝细胞索和规整形状的肝血正弦波。相比之下，TBBPA 组表现出肝细胞索紊乱和肝血正弦波形状不规则。高倍率检查显示肝细胞肿胀破裂，同时伴有炎症细胞。TP 干预减轻了这些病理变化。尽管肝血正弦波的形态尚未完全，但肝细胞结构得以保存。TP 组肝细胞的形态和肝正弦波的完整性与 C 组相当。TUNEL 染色显示 TBBPA 组中存在凋亡细胞（绿色荧光）。T+TP 组也观察到凋亡细胞，但数量显著减少。C 组和 TP 组未检测到凋亡细胞。
图 2。TBBPA 暴露及 TP 处理后鲤鱼肝脏的组织病理学和凋亡效应。TP 缓解 TBBPA 诱发肝损伤的网络药理学结果。（A） 鲤鱼肝脏的 H&E 染色和 TUNEL 染色结果。红色箭头指向炎症细胞，蓝色箭头指向受损的肝正弦波。凋亡细胞表现出绿色荧光，n = 20。（B） 筛查 TBBPA 诱导肝损伤基因及肝脏相关 TP 的维恩图。（C） 目标基因的 GO 富集环图。（D）目标基因的 KEGG 富集结果。（E） 目标基因的 PPI 网络图。（F）T 与 Bcl-2 的分子对接结果。（G 和 H）Bcl-2 蛋白表达水平检测结果，n=3。数据以平均值±标准差表示。不同字母表示组间显著差异（p < 0.05）。同一字母在各组间显示无显著差异（p > 0.05）。
为探究 TP 对 TBBPA 诱发肝损伤的治疗作用的分子机制，作者采用网络药理学技术，识别和分析疑似 TP 靶向基因及关键生物通路。TP 靶点与 206 个 TBBPA 诱导肝损伤靶点交叉，获得 175 个交叉基因，占 TBBPA 诱导肝损伤基因的 85%（ 图 2B）。进一步的 GO 富集分析显示其与线粒体、细胞质和线粒体基质的关联（ 见图 2C）。KEGG 富集分析和 PPI 网络显示，TP 主要通过癌症途径、氧化应激及其他方面干预 TBBPA 引起的损伤（ 图 2D 和 E）。此外，分子对接揭示了 Bcl-2 蛋白是治疗 TBBPA 诱发肝损伤的关键 TP 靶点（ 见图 2F）。结果显示 Bcl-2 稳定结合 TP，结合能为−8.8 kcal mol−1。蛋白质验证显示，TBBPA 暴露后 Bcl-2 表达显著下降，但 TP 干预逆转了这一变化（ 图 2G 和 H）。这些结果表明，TP 主要通过调节线粒体凋亡、炎症反应和氧化应激来缓解 TBBPA 引起的肝损伤，而 Bcl-2 在这一过程中起着关键作用。
3.3. TP 降低了 TBBPA 引起的肝脏氧化应激
图 3 显示了氧化应激和抗氧化状态的指标。TBBPA 暴露显著使肝脏 ROS 和 MDA 水平高于 C 组。TP 干预有效抑制了 TBBPA 引起的 ROS 和 MDA 增加（ 见图 3A 和 B）。对 CAT、GSH、SOD 和 T-AOC 的分析显示，TBBPA 显著损害了肝脏抗氧化能力，而 TP 则恢复了部分受损的抗氧化能力（ 图 3C-F）。这些发现在体外得到了证实（ 见图 S3）。流式细胞术分析显示，与 C 组相比，TBBPA 组 ROS 阳性细胞显著增加，而 ROS 阳性细胞在进一步使用 TP 或 NAC 治疗后显著减少（ 见图 3G 和 H）。
图 3。TBBPA 暴露和 TP 处理对 ROS 和 MDA 生成，以及鲤鱼肝脏和 L8824 细胞抗氧化能力的影响。（A） 检测到肝脏中的 ROS 水平，n=3。（B） 肝脏中 MDA 水平的检测，n = 3。（C） 检测肝脏中 GSH 的酶活性，n=3。（D） 肝脏中 SOD 的酶活性测定，n=3。（E） 肝脏中 CAT 酶活性测定，n = 3。（F） 肝脏中 T-AOC 的酶活性测定，n=3。（G 和 H） 利用流式细胞术检测 L8824 细胞中 ROS 阳性率，n=3。数据以平均值±标准差表示。不同字母表示组间显著差异（p < 0.05）。同一字母在各组间显示无显著差异（p > 0.05）。
3.4. TP 减少了 TBBPA 在肝脏中的炎症反应
PPI 网络图（ 图 2E）显示 TP 有许多与炎症因子相关的靶点。为调查肝脏的炎症损伤，检测了肝脏和 L8824 细胞炎症因子的 mRNA 和蛋白质水平。TBBPA 暴露显著提升了 IL-6、IL-1β和 TNF-α的 mRNA 水平，同时抑制了白介素-10（IL-10）表达，相较于 C 组。TP 干预显著降低了 IL-6、IL-1β和 TNF-α的 mRNA 表达，并显著提高了 IL-10 表达，相较于 TBBPA 组（ 图 4A）。TP 组和 C 组之间未发现显著差异。ELISA 结果证实了 mRNA 的发现（ 图 4B-D）。体外实验结果一致。值得注意的是，NAC 还能降低三种促炎因子的 mRNA 表达和蛋白质表达（ 见图 S4）。
图 4。TBBPA 暴露和 TP 治疗对鲤鱼肝炎反应及 NF-κB/MAPK 途径的影响。（A） 肝脏中炎症因子相关 mRNA 水平，n=3。（B） 肝脏中 IL-1β的水平，n = 3。（C） 肝脏中 IL-6 水平，n = 3。（D） 肝脏中 TNF-α水平，n = 3。（E） 肝脏中 NF-κB/MAPK 相关 mRNA 的热图水平，n=3。（F-H） 肝脏中 NF-κB/MAPK 通路的蛋白质水平及定量分析，n = 3。数据以平均值±标准差表示。不同字母表示组间显著差异（p < 0.05）。同一字母在各组间显示无显著差异（p > 0.05）。
3.5. TP 调节 TBBPA 诱导的肝脏 NF-κB/MAPK 通路激活
基于网络毒理学和药理学结果，选择了与癌症、细胞凋亡、炎症反应和氧化应激相关的 NF-κB/MAPK 信号通路进行进一步分析。TBBPA 暴露显著提高了 NF-κB-p65、细胞外调控蛋白激酶（ERK）、p38、c-Jun N-末端激酶（JNK）的 mRNA 表达，而与 C 组相比，IκBα表达显著降低（ 图 4E）。TP 组与 C 组无显著差异。与 TBBPA 组相比，TP 干预显著改变了 T+TP 组这些基因的 mRNA 表达。西方墨迹结果与 mRNA 数据一致（ 见图 4F-H）。所有组的 NF-κB-p65、p38、JNK 和 IκBα的总蛋白水平均可比。然而，TBBPA 组 p-NF-κB-p65、p-p38、p-JNK 的蛋白表达显著升高，p-IκBα显著降低。TP 干预减轻了 TBBA 诱导的 p-NF-κB-p65、p-p38、p-JNK 蛋白表达增加及 p-IκBα表达的增加。体外实验重现了这些体内发现（ 见图 S5）。作者发现 NAC 同样调节了途径相关 mRNA 和蛋白质的表达变化。
3.6. TP 抑制 TBBPA 诱导的肝脏泛性灭亡
基于分子对接结果，确定 Bcl-2 为关键靶点，作者评估了细胞凋亡相关标志物（ 见图 2F）。评估了细胞凋亡相关标志物。qPCR 分析显示，TBBPA 暴露显著上调促凋亡基因（Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Bcl-2 相关 X（Bax）），并使抗凋亡基因 Bcl-2 相较 C 组下调（ 图 5A）。TP 处理逆转了这些变化：所有促凋亡基因的表达显著降低，而 Bcl-2 表达相较 TBBPA 组显著升高。流式细胞术证实了这些结果，显示 C 组和 TP 组细胞凋亡极少，TBBPA 组细胞凋亡显著升高，L8824 细胞中 TP 显著减弱（ 见图 5G 和 H）。
图 5。TBBPA 暴露和 TP 处理对鲤鱼肝脏和 L8824 细胞 PANopsosis 的影响。（A） 肝脏中凋亡相关 mRNA 的热图形式，n=3。（B） 肝脏中热图形式中热释相关和死死相关 mRNA 水平，n=3。（C-D） 肝脏中与凋亡相关的蛋白质水平及定量分析，n=3。（E-F） 肝脏中焦凋症相关和坏死相关蛋白水平及定量分析，n=3。（G-H） 流式细胞术检测到的 L8824 细胞凋亡比，n = 4。数据以平均值表示标准差±。不同字母表示组间显著差异（p < 0.05）。同一字母在各组间显示无显著差异（p > 0.05）。
如第 3.5 节所述，TBBPA 改变了鲤鱼肝脏中的炎症因子（如 IL-1β、TNF-α），其中焦凋亡和尸死与这些变化有关。对关键调控因子的评估显示，TBBPA 显著上调了与热坏死相关的基因（NOD 样受体家族 Pyrin 结构域含 3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Gasdermin D（GSDMD）、Caspase-1）以及死死相关基因（受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（RIPK1）、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 3（RIPK3）、混合谱系激酶样蛋白（MLKL））相较于 C 组（ 图 5）B）TP 干预显著下调了所有这些基因，相较于 TBBPA 组。
西方墨迹法进一步验证了这些关键调控因子的蛋白质水平调节作用（ 图 5C-F）。体外取样结果一致（ 见图 S6）。值得注意的是，NAC 与 TP 的抗凋亡、抗焦冻和抗死尸灭性效果相呼应。
总结
总之，TBBPA 暴露对鲤鱼肝脏造成损伤，并诱发鲤鱼肝的炎症反应。同时，TBBPA 还显著提高了鲤鱼肝的 ROS 水平，并通过氧化应激激活了 NF-κB/MAPK 通路，诱导肝脏的泛性凋亡。TP 可通过降低活性氧或缓解鲤鱼肝脏的氧化应激，减轻 TBBPA 引起的炎症反应，下调 NF-κB/MAPK 通路的表达，最终减弱 TBBPA 诱导的 PANopsosis。其中，Bcl-2 是 TP 作用的关键靶蛋白。
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