微精选

研究背景

肺腺癌（LUAD）的早期演进机制长期存在认知空白——前体病变（如 AAH、AIS）如何向浸润癌转化、是否存在更早的起源细胞、微环境在其中的作用，这些关键问题尚未明确，导致临床难以实现早期精准干预。尽管已知 EGFR、KRAS 等驱动突变与 LUAD 相关，但它们在病变演进不同阶段的调控作用，以及与克隆进化的关联仍不清晰。 

为此，本研究依托多模态空间组学技术，整合空间转录组、单细胞 RNA 测序（snRNA-seq/scRNA-seq）、Xenium 单细胞空间成像及全外显子测序（WES），对 25 例患者的 56 个样本（涵盖正常肺组织、AAH、AIS、MIA、LUAD）及 19 例患者的 188 个组织芯片（TMA）核心进行分析，首次在空间和单细胞层面，揭示了肺泡祖细胞（KAC/RPII）与促炎微环境的共进化是早期 LUAD 发生的核心机制，明确了克隆进化的异质性模式及驱动突变的调控作用，为破解早期肺腺癌演进谜题提供了全新视角。

样本与方法

纳入人群与样本类型

研究纳入两类核心人群： 一是 “发现队列”，25 例未接受治疗的肺腺癌患者，采集 56 个手术切除样本，包括 11 个 AAH、14 个 AIS、4 个 MIA、26 个 LUAD 及 1 个病变旁正常组织，样本类型涵盖福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、新鲜冷冻组织，部分样本同时获取配对癌旁正常组织及外周血 二是 “验证队列”，19 例早期肺腺癌患者，构建 8 个组织芯片（TMA），包含 36 个病变样本（8 个 AAH、10 个 AIS、5 个 MIA、13 个 LUAD），共 188 个 1mm 组织核心。所有样本均经 3 位病理专家独立确认病变类型，排除鳞癌、神经内分泌癌等亚型，确保研究对象聚焦肺腺癌演进谱系。

核心测序与检测方法

采用多平台组学技术组合：

• 空间层面用 Visium 空间转录组解析区域分子特征，Xenium 单细胞空间测序实现单细胞分辨率的基因表达与空间定位
• 单细胞层面用 snRNA-seq（401635 个细胞核）、scRNA-seq 解析细胞异质性
• 基因组层面用 WES 检测体细胞突变与拷贝数变异（CNA） 同时结合多重免疫荧光（seq-IF）、类器官培养及小鼠模型实验，验证关键分子机制。

结论详解

多模态空间组学图谱：解码肺腺癌演进的区域特异性分子特征

研究通过整合多平台空间组学技术，构建了肺腺癌从正常组织到前体病变（AAH、AIS）再到浸润癌（MIA、LUAD）的高分辨率分子图谱，揭示了阶段特异性的区域表达模式。研究纳入 25 例患者的 56 个样本，涵盖正常肺组织、11 个 AAH、14 个 AIS、4 个 MIA 和 26 个 LUAD，结合 Visium 空间转录组、75 个样本的 snRNA-seq 及 6 例样本的 Xenium 单细胞空间测序，同时通过 19 例患者的 188 个组织芯片核心进行独立验证，形成 “空间 – 单细胞 – 组织芯片” 的三维验证体系（图 1a）。

经过质控后，486519 个空间斑点被保留，其中 398069 个映射到正常上皮和病变区域，88450 个覆盖免疫、基质等非上皮结构，实现了分子表达与病理形态的精准对应（图 1b）。聚类分析显示，AAH 和 AIS 的斑点聚类紧密，而 LUAD 斑点异质性显著升高，前体病变高表达 AT2 细胞标志物 SFTPC，低表达去分化标志物 KRT8 和 CEACAM5，LUAD 则呈现相反趋势，同时富集 EGFR、MUC5B 等肿瘤标志物，提示前体病变到浸润癌存在肺泡身份丢失和可塑性增强的特征（图 1c）。差异基因分析明确了各阶段的特征分子：正常组织高表达 AT1 标志物 AGER，前体病变富集 SFTPC、PGC，MIA 特征基因 CREB3L1，LUAD 高表达 MUC5AC、TFF3，且 AAH、AIS、MIA 的表达特征更相似，与 LUAD 差异显著（图 1d）。通过 iStar 技术增强空间分辨率后，基因表达与组织区域呈现强关联：SFTPC、AGER 集中在正常区域，CEACAM5 定位于肿瘤区，MS4A1（淋巴样细胞）、APOE（髓系细胞）、COL1A1（基质细胞）分别对应免疫和基质区域，直观呈现了不同细胞谱系的空间分布规律（图 1e）。这些结果首次在空间层面证实，肺腺癌演进过程中存在明确的分子特征渐变，前体病变与浸润癌的表达异质性差异为早期干预提供了靶点线索。

克隆进化轨迹：前体病变到浸润癌的三种异质性演进模式

通过 SpatialInferCNV 解析空间拷贝数变异（CNA），并整合配对前体与浸润癌样本的克隆结构，研究揭示了肺腺癌演进的三种克隆进化模式，为理解病变进展异质性提供了关键依据。研究首先通过空间 CNA 推断、克隆架构重建及与 snRNA-seq、WES 数据的交叉验证，确保克隆分析的可靠性，同时结合病理特征和肿瘤特性进行关联分析（图 2a）。根据系统发育树和前体与浸润癌的克隆共享情况，将患者分为三类模式：模式 1a（5 例）为单克隆前体，克隆在 AAH/AIS 与 LUAD 中共享且后者获得额外亚克隆；模式 1b（13 例）为多克隆前体，前体与浸润癌共享部分克隆但存在阶段特异性克隆；模式 2（5 例）为前体与浸润癌无共享克隆，提示独立起源（图 2b）。

代表性案例显示，模式 1a 的 P20 患者中，克隆 A 富集于反应性 II 型 pneumocytes（RPII）和 AAH，在 LUAD 中持续存在并衍生出克隆 B、C，且克隆 B、C 占据肿瘤核心区域；模式 2 的 P23 患者中，AIS 的克隆 B 与 LUAD 的克隆 C、D 完全不同，克隆 C 具有高非整倍体特征，克隆 D 紧邻克隆 C 且存在 6 号染色体额外 CNA，且两类患者的 RPII 均参与早期克隆形成（图 2c）。

驱动突变分析进一步揭示了克隆进化模式与关键致癌突变的紧密关联：EGFR、KRAS、MET 这三类肺腺癌核心驱动突变，在占比最高的模式 1b（13 例，占总案例 56.5%）患者中高度富集，其中 KRAS 突变尤为突出，而在模式 1a（5 例）患者中完全未检测到 KRAS 突变，MET 突变也仅在模式 1b 中出现（图 2d）。这一结果不仅证实不同克隆进化模式受差异化驱动突变调控，更凸显了 EGFR、KRAS 在肺腺癌发生中的主导地位 —— 作为临床中最常见的肺腺癌驱动突变，二者在最主要的进化模式（模式 1b）中集中出现，且该模式下前体病变与浸润癌既存在共享克隆（提示突变早期发生并持续驱动病变进展），又衍生出阶段特异性克隆（提示驱动突变可能进一步诱导新的遗传变异），充分说明 EGFR、KRAS 突变并非随机参与病变过程，而是在克隆扩张、亚克隆形成及前体向浸润癌转化中发挥核心调控作用。反观模式 1a（无 KRAS 突变）和模式 2（无共享克隆），其占比更低（分别为 21.7%、21.7%），进一步印证在多数肺腺癌演进中，EGFR、KRAS 等驱动突变是决定克隆进化方向、推动疾病进展的关键分子事件，为基于驱动突变与克隆模式的联合风险分层提供了直接依据。

肺泡祖细胞鉴定：KAC/RPII 是肺腺癌的早期起源细胞

基于 snRNA-seq 数据分析 139663 个上皮细胞，研究鉴定出 KRT8 高表达的肺泡中间细胞（KAC），其病理对应物为反应性 II 型 pneumocytes（RPII），是肺腺癌更早于 AAH/AIS 的起源前体。上皮细胞 UMAP 聚类显示，KAC 位于 AT2 细胞与肿瘤细胞之间，形成独立亚群，与 ciliated、club、基底细胞等谱系明确区分（图 3a）。肺泡谱系细胞的细分聚类中，KAC 与前体病变细胞聚类紧密，伪时间分析显示其处于 AT2→AT1 分化轨迹与 AT2→肿瘤细胞转化轨迹的交叉点，伪时间值逐步升高，且 CytoTRACE 评分降低，提示分化潜能逐渐丧失（图 3b、3c、3d）。非负矩阵分解（NMF）鉴定出 9 个上皮元程序（MP），KAC 的 MP 图谱与病变细胞相似，表现为肺泡相关 MP2 降低，肿瘤相关 MP6 升高，且与泛癌细胞状态的炎症 / 应激程序高度相关（图 3e、3f、3g）。

不同阶段的 MP 动态变化显示，从正常组织到前体病变再到 LUAD，MP2（AT2）、MP5（AT1）逐步降低，MP6（肿瘤 / KAC）逐步升高，空间层面也证实非浸润区域 MP2、MP7 更高，浸润区域 MP6 更高（图 3h、3i）。RPII 作为 KAC 的病理形态，富集 MP2（肺泡特征）和 MP6（肿瘤特征）、MP7（炎症 / 应激），位于前体和浸润癌周围，其 MP 图谱与前体病变、KAC 高度一致（图 3j、3k、3l）。克隆分析显示，模式 1a 患者中 RPII 多属于前体与浸润癌共享克隆，且共享克隆、前体特异性克隆、浸润特异性克隆的 KAC 评分均显著高于参考斑点，证实 RPII 与克隆进化的密切关联（图 3m、3n）。这些结果明确了 KAC/RPII 是肺腺癌的早期前体细胞，其兼具肺泡特征和肿瘤启动潜能，为早期干预提供了核心靶点。

促炎微环境：IL1B-IL1R1 轴驱动前体病变进展

研究通过通路富集、配体 – 受体互作及单细胞空间验证，证实前体病变中的肺泡祖细胞处于 IL1B 高巨噬细胞富集的促炎微环境中，IL1B-IL1R1 轴是核心调控通路，且该微环境在前体病变中更富集。KAC 的通路富集分析显示，促炎基因集是其最显著富集的通路类别，显著高于其他上皮亚群（图 4a）。基于空间转录组数据的 11 个元程序相关性分析显示，前体病变相关 MP3 与髓系细胞相关 MP5（巨噬细胞）呈显著正相关（ρ=0.325，p=0.037），提示前体病变与髓系细胞的空间邻近性（图 4b）。配体 – 受体互作分析显示，IL1B-IL1R1 是髓系与上皮细胞间最富集的互作之一，且主要集中在前体病变，IL1R1 在 KAC 和前体细胞中高表达，在正常 AT1、AT2 中几乎不表达，NF-κB 亚基（RELA、RELB、NFKB1）在 KAC 和前体病变中也显著升高，IL1B 在早期病变的巨噬细胞中表达高于 LUAD（图 4c、4d、4e）。空间高分辨率分析显示，IL1R1 主要定位于前体病变及 LUAD 与正常组织的交界区，IL1B 集中在病变内部及邻近区域，两者的空间共定位在 AAH 中更显著，且 RPII 和 AAH 细胞均位于 IL1B 高巨噬细胞的邻近区域（图 4f、4g）。

Xenium 单细胞空间测序验证显示，4598777 个细胞中，KAC 和炎症型 AT2 亚群（高表达 CXCL2、NFKBIA）的细胞邻域中，IL1B 高巨噬细胞亚群 C15 的数量显著高于其他上皮亚群（图 5a、5b、5c、5d、5e）。AAH 细胞高表达 IL1R1，且与 IL1B 高巨噬细胞紧密相邻（图 5f）。

组织芯片（TMA）的 Xenium 分析显示，593334 个细胞中，IL1B 高巨噬细胞亚群 C4 在 AAH、AIS、MIA 中的富集程度显著高于 LUAD，前体病变的细胞邻域中促炎细胞（如 CCL2+、IL18 + 群体）数量更多（图 5g、5h、5i、5j、5k、5l）。这些结果从分子、细胞、空间三个层面证实，IL1B-IL1R1 轴介导的上皮 – 促炎微环境互作是前体病变进展的关键驱动力，且该微环境具有阶段特异性，在前体病变中更活跃。

功能验证：促炎信号调控肺泡祖细胞增殖与病变发生

利用小鼠肺癌模型、类器官实验，研究在体内外验证了 IL1B-IL1R1 轴对肺泡祖细胞增殖和肺腺癌发生的调控作用。研究采用 Gprc5a⁻/⁻小鼠，经烟草致癌物 NNK 处理构建肺癌模型，分别在暴露结束（EOE）、3 个月（早期病变）、7 个月（LUAD）取样分析（图 6a）。小鼠上皮细胞 UMAP 显示，KAC 位于 AT1、AT2 与肿瘤细胞之间，其 TNFα-NF-κB 等促炎通路显著富集，Il1r1 及 NF-κB 亚基（Rela、Relb）在 KAC 中表达最高，且 Il1b 在巨噬细胞中的表达随时间升高，Il1r1 在 3 个月（早期病变阶段）达到峰值（图 6b、6c、6d、6e）。小鼠空间转录组分析显示，7 个月时肿瘤周围富集巨噬细胞，RPII 分散在正常实质及病变周围，KAC 特征与炎症特征在肿瘤及癌旁巨噬细胞富集区共定位，Il1b-Il1r1 信号从巨噬细胞富集区向肿瘤核心传导（图 6f、6g）。

类器官实验中，从 NNK 处理小鼠 AT2 细胞衍生的 KAC 类器官，经重组 IL-1β 处理或与肺间质巨噬细胞共培养后，数量和大小均显著高于对照组，证实 IL-1β 直接促进 KAC 增殖（图 6h、6i、6j、6k）。此外，Il1r1 敲除的 KrasLSL-G12D 小鼠，肺肿瘤发生显著减少，LAMP3+/KRT8 + 细胞（KAC 类似细胞）数量降低，进一步验证了 IL1R1 对肺泡祖细胞转化的必要性。这些结果明确了 IL1B-IL1R1 轴是调控肺泡祖细胞增殖和肺癌发生的关键通路，为靶向干预提供了功能学依据。

治疗干预：靶向 IL-1β 联合 PD-1 阻断抑制肺腺癌发生

基于促炎微环境的核心作用，研究在小鼠模型中验证了靶向 IL-1β 单独及联合 PD-1 阻断的治疗效果，证实 precancerous 阶段干预可有效抑制肺腺癌进展。实验设计两种治疗窗口：预防窗口（NNK 暴露后立即治疗 3 个月）和拦截窗口（3 个月后治疗 4 个月），分为 IgG 对照、抗 IL-1β、抗 PD-1、联合治疗四组（图 7a）。肿瘤体积分析显示，抗 IL-1β 单药在两个窗口均比抗 PD-1 更有效降低肺腺瘤和腺癌体积，联合治疗在拦截窗口的肿瘤抑制效果最显著，显著优于单药（图 7b）。支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞因子检测显示，抗 IL-1β 单药显著降低 CCL3、IL33、IL17A 水平，联合治疗进一步降低 IL23、IL21、CXCL1，提示促炎细胞因子网络的协同抑制（图 7c）。空间转录组分析显示，抗 IL-1β 治疗组的病变体积缩小，巨噬细胞浸润减少（图 7d）。

snRNA-seq 分析显示，3 个月时联合治疗组 KAC 比例显著降低，7 个月时所有治疗组 KAC 均减少，肿瘤细胞比例也以联合治疗组降低最显著（图 7e、7f、7g）。免疫荧光分析显示，联合治疗组不仅抵消了抗 PD-1 单药导致的巨噬细胞富集，还显著增加细胞毒性 CD8+T 细胞浸润，与 scRNA-seq 结果一致（图 7h、7i）。此外，抗 IL-1β 在 syngeneic 模型中无法抑制已形成的 LUAD 生长，进一步证实其干预窗口主要在 precancerous 阶段。这些结果表明，precancerous 阶段靶向 IL-1β 可破坏肺泡祖细胞转化，联合 PD-1 阻断可通过增强抗肿瘤免疫提升效果，为肺腺癌早期拦截提供了可行方案。

小结

本研究的核心突破的在于：

一是鉴定出 KRT8 高表达的肺泡中间细胞（KAC）及其病理对应物 RPII，证实其是早于 AAH/AIS 的 LUAD 起源前体细胞，兼具肺泡特征与肿瘤启动潜能；

二是揭示三种克隆进化模式（共享克隆的模式 1a/1b、无共享克隆的模式 2），发现 EGFR、KRAS 突变主要富集于模式 1b（占 56.5%），是多数 LUAD 演进的核心驱动；

三是明确 IL1B-IL1R1 轴介导的上皮 – 促炎微环境互作，前体病变中该轴活性显著高于浸润癌，是肺泡祖细胞增殖的关键调控通路。 

临床价值显著：基于克隆模式与驱动突变可建立更精准的风险分层（如模式 2 患者需更密切监测）； precancerous 阶段靶向 IL-1β 联合 PD-1 阻断，能显著抑制 KAC 增殖与肿瘤发生，为肺腺癌早期拦截提供新方案；鉴定的 KAC 标志物（如 KRT8、IL1R1）可作为早期诊断靶点，推动肺腺癌从 “晚期治疗” 向 “早期干预” 转型。