作者：岳修枫，南京农业大学博士在读，主要研究原噬菌体与土壤健康。
导读
噬菌体是地球上最广泛存在的生物体，当其整合到宿主基因组中时，被称为原噬菌体，可影响细菌的致病性、抗逆性等多种特性。该研究通过计算和实验分析，探讨了枯草芽孢杆菌中原噬菌体的多样性、分布和活性。研究发现，枯草芽孢杆菌富含原噬菌体，这些原噬菌体整合到特定的基因组热点区域。基于编码蛋白的相似性，将枯草芽孢杆菌的原噬菌体聚类为数十个群组，其中一些在全球范围内分布，另一些则局限于特定地理区域。此外，某些原噬菌体元素之间存在明显的相互作用，可能驱动它们的多样化。实验测试表明，只有少数原噬菌体可在常见诱导剂的作用下被激活。该研究基于公共基因组序列数据库和本地分离菌株库，揭示了细菌基因组进化和噬菌体–宿主动力学。
尽管原噬菌体在细菌基因组中普遍存在，对细菌的多种特性有重要影响，但其在细菌中的具体作用、分布以及与其他遗传元素的相互作用等尚不清楚。因此本研究旨在从全球和本地地理尺度上探讨枯草芽孢杆菌中原噬菌体的多样性、分布、活性及其与宿主基因组的相互作用，以及环境因素对原噬菌体分布的影响。该研究从NCBI数据库中获取大量枯草芽孢杆菌的完整基因组序列作为全球尺度的数据，同时，从斯洛文尼亚萨瓦河河岸的土壤样本中分离并测序了40个枯草芽孢杆菌菌株的基因组，作为本地尺度的数据，并对分离的菌株进行标准的实验室培养，利用不同的测序平台获取高质量的基因组序列数据。结合生物信息学分析流程以及室内实验验证证明了全球和本地分离株中原噬菌体的丰富度和分布模式的差异。通过分析原噬菌体在宿主基因组中的整合位点、不同原噬菌体之间的共现和互斥关系，揭示了原噬菌体在宿主基因组中的整合偏好及其潜在的遗传互作，同时发现大多数预测的原噬菌体在DNA损伤条件下不能被诱导，但仍能增加宿主对DNA损伤的敏感性。
一、枯草芽孢杆菌富含原噬菌体，主要位于九个整合热点区域
研究预测了大量枯草芽孢杆菌基因组中的原噬菌体，包括NCBI上所有191个完整基因组（全球尺度分离株）和40个测序的来自斯瓦河河岸土壤样本的分离株（本地分离株）。这些基因组共包含1243个原噬菌体，每个基因组至少包含一个原噬菌体元素，大多数菌株携带多达4个原噬菌体。来自局部规模菌株基因组预测的噬菌体分布略有不同，携带更多的原噬菌体（每个基因组5个），最多可达8个；在全球规模的菌株中，35株带19个或者更多的原噬菌体（图1A）。通过将预测的原噬菌体映射到宿主染色体的整合位置，发现至少存在9个原噬菌体整合热点区域。这些热点区域几乎在本地和全球尺度分离株中重叠。不同热点区域中原噬菌体的丰度存在差异，复制末端附近的原噬菌体丰度最高，而复制起点附近的丰度最低（图1B）。
图1 枯草芽孢杆菌基因组中预测的原噬菌体元件的分布
基于原噬菌体数量、片段大小和整合位点，利用vContact2构建了噬菌体的局部系统发育树，并利用clusterONE进行聚类，得到62个群组。通过与INPHARED噬菌体数据库匹配，发现大多数预测的原噬菌体可根据其与已知功能噬菌体或枯草芽孢杆菌168中先前描述的MGE的相似性进行分类（图2 A-C）。此外，还观察到一些完全未知的较大原噬菌体群组。基于与参考序列和染色体区域的相似性，将23%的预测原噬菌体分类为可能或潜在活跃的，63%为隐性或非功能性噬菌体，15%为完全未知的。
图2 预测的原噬菌体的元件聚类
通过构建基于核心基因比对的系统发育树，将枯草芽孢杆菌菌株聚类为七个系统发育群（PCs），本地菌株仅属于两个支系（PC1和PC2），两者之间的亲缘关系也比其它支系更为密切（图3）。将原噬菌体元件映射到菌株的系统发育中，发现系统发育与特定原噬菌体元件的存在相关。这些结果表明，亲缘关系密切的菌株倾向于携带相似的原噬菌体。
图3 枯草芽孢杆菌的系统发育、原噬菌体元件与国家、分离来源的关系
研究假设噬菌体元件通过阻止或促进噬菌体的获得来塑造宿主的噬菌体库，因为在PC3内的几个独特原噬菌体元件似乎共同出现在属于该分支的基因中（图3）。分析显示预测的原噬菌体元件之间存在负共现和正共现，例如，PBSX vOTU 5与九个其他vOTUs表现出排斥关系，而PBSX vOTU 6与五个vOTUs表现出耦合关系，并决定了另外三个vOTUs的存在（图4）。鉴于vOTU 5的PBSX是分布最广的噬菌体，因此研究假设保护其免受多种其他噬菌体的攻击和溶原作用可能驱动了其在物种内的维持。总的来说，原噬菌体共现分析结果表明，根据原噬菌体组的存在或不存在来预测获得或丢失属于某一组的原噬菌体元素（vOTUs）是可行的。
图5 局部分离株中活性原噬菌体的筛选
总结
本文深入探究了枯草芽孢杆菌中原噬菌体的生态分布、多样性及其与宿主基因组的相互作用。通过分析全球和本地地理尺度上的枯草芽孢杆菌基因组序列，研究人员发现原噬菌体在枯草芽孢杆菌中普遍存在且主要整合于特定的基因组热点区域。基于编码蛋白相似性的聚类分析，将原噬菌体分为多个群组，其中一些群组呈现全球分布特征，而另一些则局限于特定地理区域，这表明原噬菌体的分布与宿主菌的地理来源存在一定关联，但更受宿主菌系统发育关系的影响。研究还揭示了原噬菌体之间存在强烈的共现和互斥关系，暗示它们之间可能存在着复杂的互作网络，这些相互作用可能影响原噬菌体在宿主基因组中的稳定性和传播。实验部分，研究人员利用丝裂霉素C诱导本地分离的枯草芽孢杆菌菌株，发现只有少数原噬菌体能够被诱导产生活性噬菌体颗粒，这表明大多数原噬菌体处于隐性状态，但仍可能对宿主的生理特性产生影响，例如携带较多原噬菌体的菌株对DNA损伤的响应更强。总体而言，这项研究为我们理解原噬菌体在细菌基因组进化中的作用以及噬菌体与宿主之间的动态关系提供了新的视角，也为未来进一步探索原噬菌体的功能、传播机制及其在细菌适应环境中的作用奠定了基础。