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肺炎克雷伯菌是一种常见的革兰氏阴性菌，可作为机会致病菌引发肠道外感染。其分为经典型和高毒力型两种病理型，经典型常导致医院获得性感染，且多为多重耐药；高毒力型则常引发社区获得性感染，可导致严重的侵袭性疾病。目前，多重耐药与高毒力特性在部分菌株中出现 convergence，而新型抗菌药物的研发速度跟不上高风险 KP 克隆的出现和传播速度，治疗面临困境。噬菌体疗法作为一种潜在的替代方案，因能特异性靶向病原体且对人体菌群影响较小而受到关注。理解噬菌体与 KP 之间的生态进化动力学对噬菌体疗法的成功应用至关重要。

肺炎克雷伯菌表面多糖

CPS是KP重要的毒力因子。一般认为，CPS通过脂质锚定附着于外膜，也可通过与其他表面分子如LPS的相互作用保留在细菌表面。CPS由重复的寡糖单位组成，由此共同形成 K抗原，并定义了KP菌株的荚膜血清型（K型）。CPS可由多种不同的碳水化合物组成，包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖呋喃糖、岩藻糖、甘露糖和鼠李糖。这些糖可能被乙酰转移酶和丙酮酰转移酶进行进一步修饰。因此，通常来说CPS组成是多样的，并且在不同KP菌株之间存在差异。此外，高毒力菌株通常比经典菌株会产生更多的CPS，因此常表现为高黏液表型。另一种主要的胞外多糖为LPS，由嵌入细菌外膜的脂质A、核心寡糖结构域和重复单糖组成的高可变O抗原组成，其中重复糖单元用于定义O抗原类型。O抗原通常由半乳糖、半乳糖呋喃糖、甘露糖、核糖呋喃糖和N-乙酰-d- 葡萄糖胺等糖类组成，并可被进一步修饰（如乙酰化）形成O抗原的亚型突变体。

K抗原和O抗原分型有助于确定与KP感染更为相关的分型。最初是通过血清反应特异性对对特定K抗原或O抗原进行分型，即为血清型。K抗原最早是通过荚膜肿胀反应（Quellung 试验）进行分型，即在细菌中加入血清，然后观察特异性抗体与K抗原是否能结合从而导致荚膜肿胀。随后开发了免疫荧光、玻片凝集、双向琼脂扩散（Ouchterlony试验）、对流免疫电泳和乳胶凝集等方法来提高检测速度、准确性和效率。然而，由于多数试验需要抗血清且有抗血清数量有限，导致许多KP新的分离株无法得到有效分型。此外，不同血清型之间的交叉反应使精确鉴定具有挑战性。与K抗原分型一样，O抗原分型也需要在试管或乳胶凝集试验中进行抗血清试验，且需要无荚膜突变体，因为一般而言K抗原会掩盖O抗原。后续出现了一种不需要无荚膜突变体的酶联免疫吸附测定法，促进了O抗原的有效分型。最近，开发了基于PCR应用于K抗原和O抗原分型，包括对整个CPS合成基因簇进行限制性片段长度多态性分析以确定以及基于特定CPS合成基因如wzi、wzc和wzy等序列进行K抗原分型。而O抗原分型可使用O抗原合成基因簇 wzm-wzt基因以及wbbY区域等位基因进行鉴定。随着近年来WGS变得更加普及，基于基因组的K抗原和O抗原基因簇分型更精确和全面，以Kaptive为例的软件工具在为KP分离株开发标准化分型方案方面发挥了重要作用。Kaptive目前已能鉴定163种K抗原类型和11种不同的O抗原类型。尽管能基因组确定K抗原类型，但仍需额外表征将基因型与多糖组成联系起来。在163种不同的K抗原类型中，仅有约一半的结构得到确定。

CPS 流行病学及其对毒力的影响

KP中CPS高度多样性似乎是KP高度适应性的主要决定因素，K抗原类型具有地理分布差异。临床常见K抗原类型包括KL2、KL10、KL15、KL16、KL17、KL21、KL22、KL24、KL25、KL28、KL30、KL54、KL62和KL64。本研究调查了截止2023年10月从NCBI获取的16,475个KP基因组，这些菌株主要分离自尿液、血液或呼吸道。在这些基因组中，最常检测到的基因型是KL2、KL24、KL25、KL47、KL51、KL64、KL102、KL106、KL107和KL112，观察到不同基因组在不同地区的富集，表明了流行性的区域差异。

CPS是KP的重要的毒力因子。小鼠实验表明CPS的破坏会显著降低KP的毒性。CPS还被证明可介导逃避吞噬作用和补体介导的裂解，并限制宿主对KP感染的炎症反应。同时，CPS的量和组成也会影响KP的毒力。例如，高毒力菌株通常是高粘液表型，并且这一特征已被证明与毒力增加相关。高粘液性与特定的K抗原类型相关，包括KL1、KL2、KL4和KL5。其中，KL1和KL2已得到充分表征，并通常具有高毒力特性，能在低细菌接种量（10³个细菌）下导致小鼠致死感染，并能感染健康人群。KL1和KL2抗原类型会导致更具侵袭性的疾病，也与对吞噬作用、中性粒细胞杀伤和肝驻留巨噬细胞捕获的抗性增加相关。CPS合成基因簇能够在不同的KP菌株之间水平转移，这导致研究人员提出 KP的毒力与特定的遗传谱系相关，而不是特定的K抗原类型。最近的一些研究发现“高毒力”K抗原类型比“低毒力” 类型更能赋予逃避肝驻留巨噬细胞捕获的能力。然而，也有研究表明，将高毒力CPS转移到毒力较低的菌株中并不能完全重现高毒力表型。此外，临床KP菌株中常见CPS生物合成基因如 wcaJ和wbaP突变，进一步突显抗原类型与毒力之间的复杂关系。

脂多糖结构、流行病学及相关毒力

目前主要鉴定得到11种主要的O抗原类型，包括O1、O2a、O2ac、O2aeh、O3、O4、O5、O7、O8、O11和O12。除O11外，其它类型都已获得结构表征，并且还有四种额外类型OL101、OL102、OL103和OL104也得到基因鉴定。此外，还有一种O抗原类型O2afg与 ST258谱系相关，被认为是一种独特的类型。与K抗原不同，O抗原的结构除了由O抗原合成基因簇决定之外，还由基因簇外的基因（wbbY、gmlABD和wbVW）共同决定。例如，WbbY 糖基转移酶修饰 O1抗原类型并能将其转化为O2抗原类型。此外，有几种O抗原在结构上相似，区别在于是否存在额外亚基或是否含有乙酰化等修饰。在不同的O抗原类型中，只有少数常见于临床KP菌株。在两家德国大学医院测试的菌株中，O1、O2ab、O3和O5占82%，而在日本测试的人类来源菌株中这些O抗原类型占92%。在本研究从 NCBI获取的16,475个KP基因组中，O1/O2v1和O1/O2v2基因座是最常见的O抗原类型，其次是O3b、OL101、O4和O5。与 K基因簇相比，O基因簇的区域差异较小。LPS，特别是脂质A，具有强烈的免疫原性，是模式识别受体TLR4的激活剂。一些KP菌株能通过用特定的CPS抗原掩盖LPS来降低免疫原性。LPS也与KP的毒力有关，并通过在远离细胞膜的位置结合补体蛋白C3b，从而防止膜攻击复合物的形成和插入，有助于细菌抵抗补体介导的杀伤。O1血清型与更具侵袭性和高毒力的菌株相关，并被证明在小鼠肺炎模型中有促进菌血症的作用。此外脂质A还可能通过赋予对阳离子抗菌肽的抗性来提供毒力。

从噬菌体疗法角度研究KP表面受体多样性

抗生素是目前治疗KP感染的一线药物。但由于KP菌株具有快速获得抗性的能力，因此抗生素面临失效风险。噬菌体疗法作为治疗抗性细菌感染的替代治疗方法正受到关注。与广谱抗菌剂不同，噬菌体疗法可以特异靶向病原体，使患者免受抗生素治疗可能导致的微生物群失调。第一种KP噬菌体在一百多年前获得分离鉴定。而截至目前，已分离获得超过10,000种KP噬菌体。KP 噬菌体主要属于双链DNA（dsDNA）有尾病毒，基因组大小从5到300多kb不等。有尾病毒目噬菌体由以下部分组成：（i）头部或衣壳，包裹dsDNA；（ii）螺旋状尾部，负责将DNA注入细菌细胞质；（iii）门户复合物，连接头部和尾部；（iv）附着于基板的尾纤和尾刺蛋白，与细菌细胞表面受体相互作用以启动感染。噬菌体可根据形态特征进行分类，有尾噬菌体可分为肌尾噬菌体科（长收缩性尾部）、长尾噬菌体科（长非收缩性尾部）和短尾噬菌体科（短非收缩性尾部）。然而，这种分类方案未能准确反映噬菌体的进化地位，

国际病毒分类委员会最近提出了基于基因组的分类方法。根据这种新分类，有尾病毒目可分为47个不同的科，感染KP的噬菌体大多数属于Ackermannviridae、Autographiviridae、Demerecviridae、Drexlerviridae和Straboviridae科。最近，一个开源的可扩展噬菌体和菌株收集库（KlebPhaCol）公开，用于收集、储存和共享克雷伯菌属菌株和噬菌体。噬菌体感染细菌细胞始于表面受体的识别和噬菌体吸附，这是有效感染所必需的关键步骤，也是特定噬菌体宿主谱的主要决定因素。噬菌体感染的启动可通过与受体的不可逆结合单步或两步发生，即首先与初级受体可逆结合，然后与次级受体蛋白不可逆结合。由于需要宿主细胞受体的存在和不可逆结合才能将噬菌体遗传物质释放到细胞中，噬菌体利用其高度可变的受体结合蛋白（RBP）来识别特定的细菌表面受体以启动感染。然而，合适表面受体的存在并不能保证成功感染，因为细菌能编码保护自身免受噬菌体捕食的基因组防御系统。近年来，已描述了多种抗噬菌体防御系统。平均而言，一个 KP基因组编码六种非冗余的抗噬菌体防御系统，这些防御系统包括限制修饰、CRISPR-Cas和流产感染等。

细菌表位作为肺炎克雷伯菌噬菌体的结合受体

由于荚膜多糖（CPS）含量丰富且位于细胞外，因此很可能作为肺炎克雷伯菌（KP）噬菌体的初级识别受体。在某些细菌物种中，CPS的存在会形成物理屏障掩盖噬菌体识别受体从而阻碍其感染。但大多数KP噬菌体的有效吸附依赖于CPS的存在。在KP菌株暴露于烈性噬菌体的体外进化实验中，研究发现CPS合成突变会导致噬菌体抗性的产生。即使次级受体存在，噬菌体感染在CPS缺失的情况下仍会受到阻碍，这表明CPS对于KP噬菌体的成功感染至关重要。

由于KP噬菌体宿主谱可能主要由CPS血清型决定，因此特定噬菌体的感染性可能仅限于较少菌株。改变KP菌株K型会影响噬菌体侵染能力，使原本能够感染的噬菌体产生抗性，而原本具有抗性的噬菌体变敏感。CPS引入插入序列（IS）或其乙酰化修饰变化都会引起噬菌体宿主范围改变和/或噬菌体吸附减少。

除CPS外，某些噬菌体的感染也需要完整的脂多糖（LPS）。O抗原生物合成基因wecA和wecG突变也会降低噬菌体的吸附和感染效率[86]。然而，目前尚不清楚LPS是作为次级噬菌体受体，还是LPS对CPS的正确组装、锚定和/或定位具有重要作用。由于O抗原类型的多样性较低，靶向LPS的噬菌体可能具有更宽泛的宿主谱。除了CPS和LPS，一些表面相关蛋白也可作为噬菌体感染的识别受体，包括铁载体受体FepA和孔蛋白OmpK36（通常称为OmpC）。噬菌体受体也可能由移动遗传元件（如质粒）编码，一些噬菌体通过识别接合配对形成系统的特定成分来启动吸附。

受体结合蛋白和其他噬菌体尾部模块对宿主的识别

噬菌体宿主范围的主要决定因素是受体结合蛋白（RBP），RBP通常位于噬菌体尾部末端。KP噬菌体典型RBP由三个主要部分组成：（i）N端结构域，将其锚定到噬菌体基板或尾部的其他结构元件上；（ii）C端结构域，要么作为自伴侣蛋白，要么作为非催化性碳水化合物结合模块[85]；（iii）中间的β-螺旋结构域，具有酶活性，例如能够切割表面多糖的解聚酶结构域（图1C）。对噬菌体RBP解聚酶的多样性和作用机制的认知还较为匮乏。例如，以前认为尾刺蛋白的三聚体状态对酶的稳定性至关重要，但最近的生化研究表明，催化结构域的单体形式也具有稳定性和活性。

噬菌体RBP编码的解聚酶切割多糖糖苷键，包括CPS、LPS或生物膜基质，介导噬菌体感染的早期步骤。噬菌体解聚酶分为两大类：糖苷水解酶，包括O抗原内切糖苷酶和CPS内唾液酸酶；以及裂解酶，包括果胶酸裂解酶和藻酸盐裂解酶，特异裂解LPS、胞外聚合物、CPS或生物膜基质。底物特异性由解聚酶的酶口袋决定，该口袋识别特定的多糖残基。因此，即使受体结构或组成发生细微变化，也可能导致产生噬菌体抗性。能够降解相同多糖的不同RBP可能表现出较低的序列相似性，表明其使用的替代切割位点或存在趋同进化。

在噬菌体基因组中，尾纤、尾刺和裂解酶基因倾向于成簇排列。因此可通过水平基因转移和重组促进RBP的快速进化，以修饰催化口袋中的残基，从而获得新的酶结构域或在噬菌体之间交换尾部模块。RBP的模块化有望通过快速修饰来扩展宿主范围，从而提高噬菌体的适应性。RBP在噬菌体感染中起着关键作用，研究其与细菌表面受体的相互作用可以为噬菌体治疗提供重要的新见解。

细菌–噬菌体动态互作：相互抵抗进化

噬菌体和细菌处于共进化的竞争中，细菌试图抵抗噬菌体感染，而噬菌体则试图更有效地感染宿主。有两种主要模型来解释噬菌体–细菌的共同进化：“军备竞赛”动态和波动选择动态。在军备竞赛模型中，噬菌体和细菌的持续适应导致细菌抗性和新噬菌体的积累。这种模型中，基因型被连续选择性清除取代，导致噬菌体的宿主范围扩大，细菌则拥有大量的噬菌体抗性机制。进化后的细菌对具有祖先特征的噬菌体保持抗性，而进化后的噬菌体仍然可以感染祖先细菌。军备竞赛可能导致高适应成本，最终导致噬菌体或细菌的种群灭绝。

另一方面，波动选择模型假设噬菌体进化以克服细菌防御，但代价是不再能够感染祖先细菌。在这种模型中，细菌进化以抵抗新的噬菌体，但在这个过程中，它们可能对以前具有抗性的噬菌体变得敏感。波动选择模型意味着噬菌体保持较窄的宿主范围，大规模的选择性清除很少见。该模型预测大量噬菌体和细菌基因型共存，其动态由负频率依赖选择驱动，其中适应性随时间变化作为等位基因频率的函数，稀有基因型具有进化优势。

肺炎克雷伯菌感染的噬菌体治疗：前景与挑战

噬菌体治疗在近十年中才在西方医学中成为一种潜在可行的治疗方法，用于治疗复发性、顽固性和多重耐药性细菌感染。虽然噬菌体治疗通常被用于同情心治疗，但最近成功的治疗病例表明噬菌体作为下一代抗菌剂具有巨大的潜力。

目前，噬菌体治疗面临诸多挑战。虽然许多动物研究已经证明了噬菌体的治疗效果，但这些研究主要集中于急性全身性感染，如肺炎和菌血症，而人类临床应用目前则主要针对慢性感染，如尿路感染和关节感染。将动物研究结果外推到患者可能并不适用，因为慢性感染可能存在生物膜形成、噬菌体抗性突变产生或宿主免疫系统对噬菌体的中和反应等情况。此外，不同研究中使用的噬菌体种类繁多，包含单一噬菌体治疗和噬菌体鸡尾酒制剂。大多数临床报告使用噬菌体鸡尾酒治疗KP感染，因为这种方法能减少噬菌体抗性细菌的出现。而其他临床报告表明，单一噬菌体治疗足以解决KP感染。同时，在抗生素与噬菌体联合使用的研究中难以确定噬菌体在感染清除中的独立作用。最后，缺乏标准化的治疗方案和结果测量方法使得研究之间的比较变得困难。总体而言，尽管现有文献表明噬菌体治疗具有良好的疗效和有利的安全性，但需要进行良好控制的临床试验来稳健地衡量这种治疗方式的更广泛应用价值。

KP噬菌体的血清型特异性是一把双刃剑：窄宿主范围使噬菌体能够靶向特定分离株，同时最大限度地减少细菌交叉抗性，然而，KP血清多样性可能降低任何单个噬菌体的物种覆盖率。为解决这一问题，可采用靶向O抗原的噬菌体、预适应获得进化噬菌体或是分离能够靶向噬菌体抗性KP菌株的噬菌体与初始噬菌体组合使用等方式解决。

细菌对噬菌体的抗性被认为是阻碍噬菌体治疗进一步推广应用的巨大挑战。虽然进化出的噬菌体抗性可能会限制治疗效果，但它也可能导致有益的适应性权衡。例如，进化出的噬菌体抗性可能导致细菌对抗生素的敏感性增加、对其他噬菌体的敏感性改变以及细菌毒力的变化。因此，即使噬菌体治疗不能直接清除KP，也可以用于引导细菌群体朝着更易于治疗的表型发展。由于靶向KP的噬菌体通常依赖CPS进行吸附，噬菌体抗性的出现通常涉及细菌CPS的改变或缺失。无荚膜的KP突变体接合率更高，因此更有可能获得多重耐药性。CPS缺失还可以增强对膜靶向抗菌肽的耐受性。此外，体外噬菌体处理后可能导致KP持留细胞的形成，当暴露于致死浓度的抗生素时，这些突变细胞的存活率会大大增加。这些持留细胞还减缓了细菌–噬菌体共同进化和选择的速度，促进抗噬菌体防御，并逃避抗生素杀伤。而另一方面，无荚膜KP变体胃肠道定植率可能降低，毒力减弱。总体而言，理解由噬菌体共存和噬菌体抗性进化驱动的权衡可以为噬菌体疗法的开发提供理论基础。

噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染展望

除了噬菌体本身，其编码的各种与宿主裂解相关的酶（主要为溶菌酶和解聚酶）也具有较大的应用潜力。这些酶在对抗细菌感染方面显示出前景，且几乎没有副作用。溶菌酶是噬菌体编码的可消化细菌细胞壁肽聚糖的酶。研究表明，外源添加溶菌酶在体外和体内均表现出抗菌活性。此外，对溶菌酶的抗性很少见，可能是由于其靶向细胞壁的高度保守区域。解聚酶能降解碳水化合物，对CPS、LPS或其他胞外多糖表现出高度的底物特异性。解聚酶也可以降解KP生物膜，使细菌对抗菌剂或免疫系统更敏感，从而促进感染清除。然而，大分子量的解聚酶可能具有较低的组织穿透性，会刺激免疫反应并促使中和抗体的产生。此外，解聚酶的有效性可能会因细菌表面相关多糖的修饰或变异而出现抗性而受到限制。

利用机器学习和建模方法，也可为设计有效的基于噬菌体的治疗策略开辟了新的可能性。例如，最近开发的基于噬菌体–细菌相互作用预测以确定最佳噬菌体组合的算法，可适用于 KP。开发预测高度特异性和优化的噬菌体鸡尾酒的自动化方法将为大规模、精确和个性化的噬菌体治疗铺平道路。