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地下水是地球上重要的淡水资源，微生物是其生物地球化学循环的核心驱动者。与地表环境不同，地下水受人类干扰较少，是研究生态系统中微生物与噬菌体共进化的理想环境。据估计，原核生物与噬菌体已共同进化超4亿年。生态系统中噬菌体的数量庞大（约10³¹个，是细菌数量的10倍以上），是微生物进化的主要驱动力（每天约导致20%细菌死亡）。原核生物也已发展出包括先天免疫（如限制-修饰系统）和适应性免疫（如CRISPR-Cas）等多种防御系统以应对噬菌体侵染，目前已发现的150多种防御系统仍远未覆盖其复杂性。现有研究多聚焦于可培养微生物，对地下水等自然环境中大量未培养微生物（如候选门辐射类群CPR以及DPANN古菌等）的防御系统知之甚少。CPR细菌和DPANN古菌是一类地下水中的超小共生微生物，其基因组精简且代谢潜力有限，可能因噬菌体感染进化出独特的防御系统，但相关研究较为匮乏。本研究旨在通过构建地下水原核生物防御系统目录，揭示地下水系统中原核生物的防御特征以及与噬菌体的共进化机制。

1. 构建全球首个地下水原核生物防御系统目录（GPDC）

研究团队于2016年-2017年期间共采集了中国525个新监测井以及82个改造井的607个地下水样本，共覆盖7个地质区域。水样采集后经0.22μm滤膜收集微生物进行DNA提取及测序。利用metaWrap进行MAGs组装、Checkm评估基因组质量、dRep进行去冗余操作以及GTDB-Tk进行MAGs物种注释。利用DefenseFinder进行MAGs防御系统基因的识别，DefensePredictor进行潜在防御基因的预测。最终整理获得地下水原核生物防御系统目录（GPDC），共识别了190,810个防御基因以及90,824个防御系统，涵盖139个防御家族和669个防御岛，涉及141个原核生物门中27,528个细菌MAGs以及1453个古菌MAGs。与与NCBI RefSeq数据库比对分析表明，GPDC中94.1%的防御基因为首次发现，提示地下水是未开发的微生物免疫资源库。其中R-M、SoFIC、CRISPR-Cas、AbiE、MazEF五个防御系统家族占总防御系统的69.2%且多样性较低，被定义为地下水中的“一线防御”系统。其中R-M最普遍（存在于50%的细菌MAGs中），是抵御噬菌体的核心力量，这与之前在土壤、人体肠道以及海洋环境中结果较为一致。而其他防御系统如CBASS、Wadjet、Septu等共占防御家族30.8%，但涵盖96.4%多样性，作为“辅助防御”系统可能通过灵活调整增强防御范围。

图1 地下水细菌的防御系统。A：防御家族在细菌MAGs中的分布（R-M系统占比最高）；B：94.1%的防御基因为首次发现；D：防御系统数量呈指数分布（多数MAGs含 0-3 个，少数为“超级载体”）；F：56.4%效应器主要依靠降解病毒核酸发挥作用。

在地下水原核生物类群中，绝大多数仅存在3个左右的防御系统，28%类群缺乏防御系统，而有一小部分（0.97%）装备超过20个防御系统。这种“超级防御体”主要分布于假单胞菌门，具有较大的基因组以及较多的编码基因。地下水原核生物较之海洋类群具有较多的防御系统，表明地下水环境存在活跃的病毒–宿主互作关系。

防御系统通常由两个主要组件组成：检测病毒感染的传感器和攻击噬菌体或消除受感染细胞以防止噬菌体复制的效应器。降解病毒核酸的效应器占所有防御系统的56.4%。效应器一般包括裂解病毒核酸的靶向系统如CRISPR-Cas以及R-M系统等和导致细胞死亡或休眠从而抑制病毒复制的非靶系统如CBASS、Gabija以及毒素–抗毒素系统等。有36.9%的防御系统具有未知效应器基因，表明可能具有新型的防御机制。相关性分析表明，越大的基因组具有越多的防御系统，表明可能经历过多次外来核酸物质的入侵因此需要更完备的防御工事。而防御系统的密度也跟不同地区的地下水环境具有显著相关。

2. 不同微生物类群的防御策略

在27,578个细菌MAGs中，假单胞菌门具有最多数量的MAGs，其次是CPR类群。CPR细菌类群是一类基因组精简的水生细菌共生菌，具有较少的防御系统，这些超小基因组类群可能通过动态获取或丢失防御系统以应对地下水贫瘠环境的限制和病毒攻击。CPR的防御系统密度显著高于其他类群，且具有较高的多样性。或表明其面临强烈的病毒攻击。

图2 防御系统的宿主特征。A-B：CPR 的防御系统密度显著高于其他类群；C-D：不同门MAGs基因组大小及防御系统多样性；E：弯曲杆菌门、硝化螺旋菌门等化能自养菌的防御多样性更高；F：不同门的防御家族分布存在特异性（如 Myxococcota 富含 AbiE）。

防御系统在不同的细菌门和古菌门之间存在很大差异，这可能归因于不同生活方式所塑造的泛基因组差异。四个细菌门（Campylobacterota，CPR，Nitrospirota以及Nitrospinota）中防御家族多样性较高。Campylobacterota是一类可利用硫，氢，砷和硝酸盐的化能自养型细菌。其具有丰富的噬菌体防御系统，表明作为生产者能有效应对病毒侵染。同样，Nitrospirota以及Nitrospinota这一类在海洋和地下水环境中广泛存在的与亚硝酸盐氧化密切相关的类群，也具有丰富的防御系统，可能与其化能无机自养生活方式相关。Myxococcota具有复杂的多细胞群体行为，能通过“wolf-pack attack”形式捕食其他微生物，具有最高多样性的防御系统。Myxococcota中高水平的AbiE系统表明其可通过诱导细胞快速死亡来防止病毒释放以促进群体幸存。古菌中DPANN也是一类具有较小基因组大小的共生类群。DPANN类群的防御系统数量、密度及多样性均显著低于Euryarchaeota，其防御系统和生活方式之间可能存在更为复杂的相关性。但是其具有较高的防御系统密度，表明面临强烈的噬菌体感染强度。产甲烷古菌Methanobacteriota主要携带R-M和CRISPR-Cas系统而缺乏AbiE系统，表明其可能采取避免细胞死亡的防御策略。

图3 病毒感染强度与防御系统的关系。A-C：防御系统数量/密度/多样性与病毒–宿主比（VHR）正相关；D-G：CPR中Paceibacteria 类群、DPANN中Nanoarchaeota 防御多样性最高，对应最强的噬菌体压力。

3. 防御系统与适应性特征的权衡

元件整合和移动体现了防御系统和抗性基因获取的权衡策略。在地下水环境中，防御系统的数量与适应性特征基因的获取数量正好相反，例如“第一防御”系统拥有数量与微生物基因组中的抗生素抗性基因（ARGs）、重金属抗性基因（MRGs）、毒力因子基因（VFGs）数量均呈显著反比，表明地下水微生物在维持稳定的免疫系统以及获取外来的适应性特征之间存在进化平衡策略。拥有较少防御系统的类群可能具有更频繁的HGT事件以及整合更多的毒力及抗性基因。ARGs扩散已经对人类和环境健康构成重大威胁，噬菌体疗法已成为对抗耐药感染极具潜力的替代方法。由于防御系统和适应性特征（包含抗性特征）之间的权衡进一步强调了利用噬菌体抑制多重耐药细菌的应用潜力，因为这些细菌通常具有有限的防御系统，因此更容易被噬菌体侵染裂解。

图4 防御系统与适应性特征的负相关关系。A-B：防御系统数量增加，ARGs数量骤降；C-F：一线防御系统（如AbiE）的抑制作用更显著。

4. 移动元件（MGEs）驱动防御系统传播

以往研究表明MGEs能携带防御系统，促进其传播。在地下水系统中，我们在27,578个细菌MAGs中检测到163,897个质粒、40,302个噬菌体/原噬菌体、2697个整合子和606个ICEs/IMEs，其中假单胞菌门数量最多。CPR类群的噬菌体/原噬菌体数量最多，进一步验证了其经历强烈病毒侵染的假设。与染色体区域相比，防御系统更密集地定位于MGE，几乎所有类型的MGE都携带来自各种防御家族的防御系统数量。大部分辅助防御系统优先定位于MGE，表明微生物可能通过水平获取或丢失辅助防御系统动态适应环境。此外，防御家族之间存在不同的定位偏好，BstA系统更常见于噬菌体/原噬菌体序列上，而dGTP酶倾向于定位于质粒上。研究结果表明防御系统和MGE之间存在复杂的相互作用。

图5 移动遗传元件与防御岛。A-B：MGEs 在不同细菌门中的分布；C：MGEs与染色体的防御系统密度对比；D：防御家族与 MGEs 的共定位频率（O/E 比）；E-I: 防御岛的特征：防御岛中 61% 为辅助系统，辅助系统更倾向位于防御岛。

防御系统通常聚集在称为防御岛的特定基因组区域，因此防御岛研究可能是发现新型防御系统的途径。本研究共识别到669个防御岛，其中61%的基因为辅助防御系统基因，可能表明防御岛是辅助防御系统“储备库”。其余基因可能在防御过程中起到辅助作用或者代表新的防御系统。这些基因中部分注释与复制、重组、修复、转录和防御系统相关，可能在细胞信息存储及信号传导中起重要作用，经注释包括I型限制性修饰DNA特异性结构域（K01154），ATP依赖性DNA解旋酶（K03655）和WYL转录调节因子等，并且还存在包括IV型分泌系统等攻击系统，表明防御岛可能不仅行使防御功能还具有进攻潜力。

5. 噬菌体的反防御机制

图6 噬菌体反防御基因的特征。A：噬菌体中反防御基因的共定位，反防御基因常聚集分布；B：抗 CRISPR（Acr）蛋白系统发育树，41个Acr蛋白覆盖多种亚型，表明Acr蛋白多样性高，且部分为新发现类型；C-D：CRISPR-Cas9与 AcrIIC1相互作用，Rugosibacter CRISPR-Cas9系统可靶向某噬菌体原间隔区，噬菌体通过AcrIIC1结合Cas9 的 HNH 结构域抑制其功能。

为了应对多样化的原核防御系统，噬菌体也相应进化出多种抗防御机制以确保成功侵染。抗防御系统在原核生物及噬菌体军备竞赛中发挥着至关重要的作用，推动了原核生物防御系统和病毒反抗策略的多样性进化，本研究从总数40,302个中625个噬菌体中鉴定出712个反防御基因，这些基因主要针对R-M（26.2%）、CRISPR-Cas（27.4%）和Thoeris（27.7%）系统；部分噬菌体同时携带反防御基因和防御系统，既能逃避宿主免疫，又能抵御其他MGEs竞争。为研究历史病毒–宿主互作事件，将CRISPR间隔区与噬菌体protospacer（噬菌体靶向CRISPR-Cas系统的反防御基因）进行比对，预测得到细菌对601个噬菌体存在适应性免疫，其中43个噬菌体共携带54个抗防御基因：包括抗CRISPR（27个）、抗RM（8）、抗Thoris（8）、抗CBASS（6）和抗Dnd（5）。其他反防御类型的存在表明潜在的交叉防御相互作用，细菌可能利用CRISPR-Cas系统消灭携带其他类型抗防御基因但不携带抗CRISPR的噬菌体。通过进一步对病毒Acr基因（抗CRISPR-Cas系统）进行多样性分析，结果表明预测的ACR蛋白在不同亚型中显示出广泛的分布，计算模型确认了其具有不同的结构。其中，抑制噬菌体编码的新型Acr蛋白蛋白可靶向新发现的Rugosibacter SP002422995中新发现的CRISPR-Cas9系统，这种相互作用可以为基因编辑应用提供新的调控观点。

研究通过分析获得了全国范围内陆下水原核生物的防御系统目录，扩展了原核生物防御系统的知识库。基于一线防御和辅助防御系统，描绘了微生物完善的防御系统模式。微生物由于生态功能差异进化获得多样防御策略，而原核生物与噬菌体之间的军备竞赛驱动双方获得协同进化，最终形成防御系统–反防御系统的相互制衡。CRISPR-Cas防御系统在许多环境中发挥重要作用，而新发现的来自Rugosibacter sp002422995 的完整CRISPR-Cas9系统及其与Acr基因的相互作用可能为基因编辑提供了新型工具。研究为理解地下水生态系统的病毒–宿主共进化提供了新的知识框架，也为噬菌体疗法（对抗多重耐药菌）和基因编辑技术（CRISPR-Acr基因编辑）提供了理论基础。