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肌腱老化与细胞和组织的功能衰退有关，从而导致肌腱功能紊乱，如肌腱断裂和活动受限。肌腱的动态平衡和修复依赖于肌腱干/祖细胞的功能。细胞外小泡是一种膜封闭结构，主要分为外周小体和微囊两大类。EVs被认为是组织再生和修复的优秀治疗方法。最近，EVs被证明是年轻血液中有益的成分，可以延长小鼠的寿命，这表明一些特定的EVs可能具有抗衰老功能。
1. 年轻的SHED-Exos生物纳米粒对AT-SCs的再生作用和提高其成腱分化能力的研究
为了获得年轻的外泌体生物纳米颗粒，采用超速离心和过滤等步骤从培养上清液中提取外泌体。纳米颗粒跟踪分析显示，细胞颗粒的纳米尺寸为≈125纳米，并且组之间没有显著差异(图1a)。SHED-Exos和DPSC-Exos的TSG101、CD63和CD9均呈阳性(图1b)。我们分别对DPSC-Exos和SHED-Exos进行了蛋白质组学分析。SHED-Exos包含的差异表达蛋白质数量明显多于DPSC-Exos(图1c)。相反，与衰老发育相关的几条潜在通路，在DPSC-Exos中(图1d)。包括转化生长因子-β信号通路、Janus激酶信号转导和转录信号通路激活子，以及Th17细胞分化明显增加。随后，我们构建了一个基于字符串数据库的蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)。PPI分析表明，这些差异表达的蛋白质保持着积极和相互作用的关系(图1e)。
有趣的是，SHED-Exos处理促进了更多的球体形成，半径增加，Ki67表达增加(图1h)。此外，SHED-Exos治疗还提高了抗氧化剂相关基因的mRNA表达，包括超氧化物歧化酶1(SOD1)、过氧化氢酶(Cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX1)，这些基因已被证明可以影响干细胞衰老并诱导肌腱病变进展(图1m)。
图1 SHED-Exo生物纳米颗粒促进AT-SC茎干，延缓AT-SC衰老。
在这项研究中，SHED-Exos生物纳米颗粒逆转了AT-SCs肌腱分化下降的趋势，表现为胶原沉积增强，与肌腱形成相关的I型胶原(COL1)和纤维调素(FMOD)表达增加(图2a，b)。HE染色和免疫荧光染色显示，脱脂处理的AT-SCs有大量新的肌腱胶原纤维，肌腱发生相关标志物硬化轴(SCX)和肌腱调节蛋白(TNMD)的表达增加(图2c，d)。此外，钙结节形成减少，成骨相关因子Run-Related转录因子2(Runx2)和骨钙素蛋白(BGLAP)在mRNA水平表达减少，这与Western blotting结果一致(图2e-g)。
这些结果证实了SHED-Exos可以逆转AT-SCs偏向的成骨和成软骨分化。
图2 SHED-Exos生物纳米颗粒保持AT-SC的拉伸能力，并抑制其软骨分化和成骨分化。
2. SHED-Exos通过降低H3K9me3和H3K27me3丰度并抑制NF-κB逆转AT-SC老化
鉴于组蛋白修饰在衰老过程中的作用，我们调查了SHED-Exos生物纳米颗粒是否通过修饰组蛋白标志物发挥其抗衰老功能。免疫荧光染色显示，SHED-Exos处理显著降低18月龄大鼠分离的AT-SCs中H3K9me3和H3K27me3的水平(图3a，b)。Western blotting分析证实H3K9me3和H3K27me3表达下调(图3c)。连续4天应用2微米JIB 04在蛋白质水平上抵消了Share-Exos对H3K9me3和H3K27me3的下调效应(图3d)。Western blotting结果表明，JIB 04处理可抵消SOX2和OCT4蛋白水平的上调(图3e)。此外，CFU-F的数量显著下降(图3f)。有趣的是，SHED-Exos对P21的抑制作用也被补充JIB 04所抵消(图3g)。AT-SCs成骨分化明显增强，茜素红染色增强，RUNX2蛋白水平升高(图3i，j)。
此外，天狼星红染色显示，SHED-Exos处理可以有效地纠正炎症刺激诱导的肌腱分化能力的减弱。
图3 SHED-Exos生物纳米颗粒通过降低H3K9me3和H3K27me3的丰度来延缓AT-SC衰老并保持AT-SC的拉伸能力。
3. 生物活性SHED-Exos纳米粒延缓老年小鼠退行性肌腱病
肌腱的自发钙化随着年龄的增长而发生，这可能是由于AT-SCs的偏向分化和慢性、较低的炎症刺激所致。为了检测SHED-Exos生物纳米颗粒是否可以改善老年肌腱退化的进展，我们在老年小鼠身上静脉注射了这些生物纳米颗粒八周。与未经治疗的小鼠相比，SHED-Exos处理的小鼠的后肢功能得到了改善，这从握力水平的增加可见一斑。
随后，进一步探讨了肌腱的衰老和炎症状态。免疫荧光显示，与赋形剂对照组相比，使用SHED-Exos两个月后，SHED-Exos治疗组肌腱衰老相关标志物P21的表达水平显著降低。RT-qPCR结果显示，给予SHED-Exos后，肌腱组织中炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α和IL-6的基因表达显著降低。此外，免疫荧光染色显示，SHED-Exos给药显著降低了18月龄小鼠跟腱切片中H3K9me3、H3K27me3和P65阳性细胞的百分比。
总体而言，全身给药的生物活性SHED-Exos纳米颗粒部分挽救了衰老诱导的老年小鼠的肌腱退化。
4. 负载SHED-Exos纳米粒子的水凝胶微球有效地恢复AT-SCs的活力并保持其致腱分化
为了探索局部给药的抗衰老和促修复作用，制备了GelMA水凝胶微球来负载生物纳米粒，由于其良好的粘附性，GelMA被聚多巴胺(PDA)聚合表面修饰(图4a，b)。如图4c所示，GelMA微球(GM)呈现白色外观，而经PDA修饰的微球(GM@PDA)为浅棕色。元素图谱也显示，Gm@PDA表面的氮信号(绿色)表明PDA涂层(图4d，e)。荧光染色证实绿色染色的TSPC和红色染色的SHED-Exos被有效地负载到GM@PDA上(图4f)。CCK8定量实验表明，GM@PDA和SHEDExos显著增强了3-4天的细胞增殖活性。
这些结果进一步表明，复合微球具有良好的生物相容性。我们系统地研究了GM和GM@PDA中外泌体的载药效率和释药特性。GM只有在浸泡6h后才达到最大载药量3.59±0.51ug mg−1微球(图4I)。外切体体在37℃、60rpm下体外释放14d。如图4J所示，在最初的三天内，外泌体从GM中出现明显的爆发式释放，随后几天的释放量相对较低。然而，GM@PDA在更长的时间内表现出较长时间的外泌体量增加的持续释放。
图4 GM@PDA&SHED-Exos微纳复合材料的表征。
5. 局部应用脱落型水凝胶微球有效促进肌腱病变和部分肌腱切断的恢复
即使在年轻人群中，细胞衰老也有助于胶原酶诱导的肌腱病的进展。因此，为了证明局部注射GM@PDA和SHED-Exos对肌腱损伤的治疗效果。我们首先建立了一个三个月龄的小鼠跟腱病变模型，该模型是由I型胶原酶诱导的(图5a)。我们在0周、1周和2周三次注射GM@PDA和SHED-Exos的轮廓，而GM和GM@PDA组的肌腱仍然呈现红肿的外观(图5b)。Micro-CT图像显示GM@PDA和SHED-Exos组有小的异位骨形成(图5c)。注射四周后，GM@PDA和SHED-Exos处理的肌腱显示出接近正常肌腱的较小的负AFI值，反映出比GM和GM@PDA组更好的运动性和更大的握力(图5d，e)。HE染色显示，与其他组相比，局部注射GM@PDA和SHED-Exos组显著减少了空泡样结构的形成，促进了排列整齐的胶原结构的恢复(图5f)。这表明GM@PDA&SHED-Exos更好地发挥了治疗效果(图5g)。
此外，GM@PDA和SHED-Exos减轻了软骨基质的沉积，软骨形成标志物COL2和AGGRECAN的表达降低(图5h)。免疫荧光染色显示，术后4周，GM@PDA&SHED-Exos组肌腱内有较大的CD146阳性细胞簇，并伴有衰老相关标记物P21的表达减少(图5I)。
图5 局部注射含SHED-Exos纳米粒的水凝胶微球可有效延缓胶原酶L诱导的3月龄成年小鼠肌腱病变的进展
为了进一步验证GM@PDA&SHED-Exos在相对较老的阶段对肌腱损伤的更好治疗效果，18个月龄大鼠被如前所述被部分切割，随后在肌腱损伤后0、1和2周用20 mg微球溶液注射所有类型的微球(图6a)。注射8周后，除GM@PDA&SHED-Exos组外，所有组均出现异常肿胀和收缩(图6b)。与GM和GM@PDA组相比，GM@PDA和SHED-Exos处理的肌腱的负AFI值较小，接近正常未损伤肌腱的负值，表明8周时运动性更好，握力更大(图6c)。Micro-CT图像显示GM@PDA和SHED-Exos组异位骨形成较小(图6d)。与其他组相比，局部注射GM@PDA&SHED-Exos组在很大程度上减少了空泡样结构的形成，并促进了排列的胶原结构的恢复(图6e)。此外，GM@PDA和SHED-Exos减轻了软骨基质的沉积，阿尔新蓝染色和降低了软骨形成标记COL2和AGGRECAN软骨基质的表达(图6g，h)。
图6 局部注射SHED-Exos水凝胶微球可挽救老年大鼠受损的内源性修复能力
结论
综上所述，基于利用天然生物活性纳米颗粒的抗衰老功能的概念，我们观察到SHED-Exos可以有效地抑制AT-SC的衰老表型，并挽救其韧性分化能力。从机制上讲，SHED-Exos主要通过抑制组蛋白甲基化和抑制NF-κB的过度激活发挥作用。最后，水凝胶微球局部传递SHED-Exos生物纳米粒具有良好的抗衰老作用，包括减少衰老细胞和减少异位骨形成，从而从功能和结构上拯救老年大鼠内源性肌腱的再生和修复能力。目前的发现为开发基于外切体的治疗年龄相关疾病开辟了新的途径。
在该研究中，研究人员使用了赛昂斯大小鼠抓力测定仪来进行实验操作。
SA415 大小鼠抓力测定仪
大小鼠抓力仪（ Grip Strength Meter）对大、小鼠抓力进行测试是为了评价药物、毒物、肌肉松驰剂、中枢神经抑制剂、兴奋剂等对动物肢体力量的影响程度，同时也可对动物的衰老、神经损伤、骨骼损伤、肌肉损伤、韧带损伤程度以及其恢复程度进行鉴定，这是一种使用范围很广的仪器。由于该仪器操作简单，使用方便，指标明确，特异性强而广泛地被国内外科研工作者使用，收到了很好的实验效果。适合大、小鼠不同大小的爪子，能测到动物真实而客观的抓力，仪器自带分析软件自动计算均值的功能进行数据导出，方便实验人员进行生物学统计。
// 技术参数
1、最大荷重(CAPACITY):50N;
2、本机带电池可续航20小时；
3、高精度高分辨率，准确度0.5级，最小读数达0.01N;
4、最大值保持功能。最大值显示直至手动清零；
5、感应式背光灯，开启关闭可自由设定；
6、USB串口输出功能，可将测试数据通过数据线输入电脑得到测试曲线图， 并可导出做各种详细的分析；
7、附带的软件可将数据导出到excle或TXT 文件；
8、拉力角度可调；
9、配有大小鼠6个网格配件可做大小鼠前后肢实验；
10、测试曲线图可导出JPG 格式，可进行文献插入；
11、净重(WEIGHT):2kg。