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scRNA-seq 对来自癌症的活细胞和来自四名癌症患者的癌旁组织进行了测验。在八个组织样本中总共鉴定出 73645 个单细胞，导致在降维和无监督细胞聚类后将这些细胞分类为 25 个不同的簇（图1A）。细胞簇比例的分布在组织样本中各不相同，如随后的分析所揭示的那样。不同阶段的癌组织和癌旁组织都表现出不同的细胞簇百分比（图 1B），表明在 GC 发育过程中细胞簇比例发生了高度复杂的变化[16]。进一步注释将 25 个细胞簇分为 10 种不同的类型，包括 T/NK 细胞、B 细胞、浆细胞、髓系细胞、中性粒细胞、肥大细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和内皮细胞。对不同阶段的细胞百分比的分析揭示了组织样本之间的差异，特别是上皮细胞和 T/NK 细胞的比例（图 1C）。此外，还检查了这 10 种细胞类型在癌症和癌旁组织中的百分比，以探索两种组织中的特定细胞组成和异质性。总体而言，T/NK 细胞明显在癌组织中升高，同时上皮细胞显着减少（图 1D）。上述结果表明，在组织内不同发育阶段，细胞类型的分布不同。值得注意的是，在 T/NK 细胞和上皮细胞的群体中观察到显着变化（图 1E）。在比较癌组织和癌旁组织时，这种现象也很明显（图 1F）。由 10 种不同细胞类型鉴定的标记蛋白如图 1G 和 H 所示。具体而言，CD2、CD3 和 CD3D 代表 T/NK 细胞，而 KRT19、KRT8 和 EPCAM 代表上皮细胞。
胃癌四个不同阶段的全球单细胞图谱。 答：从 25 个细胞簇中捕获的 73645 个细胞的单细胞图谱。左侧显示组织样本，右侧显示细胞簇，颜色表示细胞类型;B 和 C：各种组织样本中细胞簇和细胞类型的组成 （n = 8）;D：癌症（n = 4）和癌旁组织（n = 4）中不同细胞类型的比例;E：不同细胞类型中的组织样本分布;F：癌症和癌旁组织在不同细胞类型的分布;G 和 H：识别细胞类型的相应标记基因的点图和热图。
基于上述发现，在癌组织中相对于癌旁组织以及不同阶段的肿瘤组织内观察到上皮细胞比例的显着差异。为了进一步表征 GC 进展过程中上皮细胞的分布，最初根据恶性肿瘤细胞的恶性评分对恶性肿瘤细胞进行分类[17]。结果表明，绝大多数恶性肿瘤细胞集中在上皮细胞中（图 2A）。在鉴定肿瘤细胞后，检查不同阶段患者癌组织中不同细胞类型分布。研究结果显示，I、II 和 IV 期肿瘤细胞比例显着升高，III 期显着下降（图 2B）。鉴于这些，分别对上皮细胞（图 2C），恶性细胞（图 2D）和非恶性细胞（图 2E）进行重新聚类，每个细胞表现出 15 个细胞簇。这些簇充分表现出不同的基因表达模式（图 2F）。所提供的数据表明，在整个 GC 进展过程中，上皮细胞内存在 15 种不同的细胞状态。在簇 1 中，观察到表现出恶性特征的肿瘤细胞丰度较低。
肿瘤细胞鉴定和上皮细胞重新聚集。 答：癌细胞鉴定后的均匀流形近似和投影（UMAP）图，左边是组织样本，右边是细胞类型;B：癌细胞鉴定后不同阶段患者组织样本中不同细胞类型的比例;C-E：上皮细胞重聚（C，左：组织样本，右：细胞簇）、恶性细胞重聚（D，左：恶性细胞，右：细胞类型）和非恶性细胞重聚（E：左：非恶性细胞，右：细胞类型）的 UMAP;F：恶性肿瘤细胞与非恶性肿瘤细胞重聚的鉴别分析。
GC 进展受 T 细胞的显着影响[18]。先前的结果表明，癌组织、癌旁组织和不同阶段的癌症中存在多种 T 细胞亚型。为了进一步探索这些观察结果，对 25 个不同细胞簇的 T 细胞分布进行了初步检查。研究结果表明，在多个细胞簇中存在明显的 T 细胞其中，CD4 和 CD8 T 细胞被发现在对抗肿瘤细胞中至关重要，它们在不同细胞簇中的分布显示出清晰的分离，没有交集。
CD4 T 细胞重新聚集（图3A）显示癌组织中的细胞簇 2,3,4 和 6 明显升高，而不是癌旁组织（图 3B）。值得注意的是，簇 6 的增殖标记物增殖细胞核抗原和增殖标志物 Ki-67 的高表达，而簇 4 中免疫检查点标志物 PDCD1 和 C-C 基序趋化因子受体的水平升高，簇 3 中具有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域的 CTL4A 和 T 细胞免疫受体水平升高（图 3C).这些结果表明 CD4 T 细胞在肿瘤微环境中向更增殖和耗尽的状态转变，可能有助于肿瘤的免疫逃避。
CD4 T 细胞重聚类和准时间分析。A：CD4 T 细胞重聚的均匀流形近似和投影，左边是组织，右边是细胞类型;B：癌组织和癌旁组织中不同 CD4 T 细胞簇的比例;C：点图，说明标记基因在 6 个主要鉴定细胞簇中的平均表达水平;D：准时间分析，显示细胞轨迹的准时间分布（左上）、分化状态下的细胞轨迹（右上）、样本细胞轨迹（左下）、子集细胞轨迹（右下）;E：分化状态下差异基因表达的散点图;F：分支差异基因分层聚类热图。
通过准时间分析进一步检查 CD4 T 细胞的分化轨迹。结果说明了五个不同的分化阶段，CD4 T 细胞从癌旁组织逐渐转变为癌组织。在分化的第三阶段，在癌组织中占主导地位的簇 3,4 和 6 表现出明显的聚类趋势（图3D）。在 B 细胞易位基因 2、C-C 基序趋化因子配体 20、双特异性磷酸酶（DUSP）2、热休克蛋白家族 D 成员 1、热休克蛋白家族 E 成员 1、Jun 原癌基因、AP-1 转录因子亚基和 G 蛋白信号传导调节因子 1 等基因中观察到显著上调，在分化初始阶段再生家族成员 1-α升高（图 3E).这些发现表明，CD4 T 细胞在从癌旁环境过渡到癌变环境时经历了动态分化过程，可能影响肿瘤进展和免疫反应。基于分支差异基因的分层聚类热图，这些细胞表现出不同的表达状态（图 3F）。随后，确定了表达水平变化最明显的前 10 个分支。此外，在检查这些基因沿分化轨迹的表达模式时，I 期和 V 期的表达趋势与其他阶段观察到的表达趋势不同。 生成轨迹图来说明癌组织、癌旁组织和不同 CD4 T 细胞亚群不同阶段的前 10 个差异表达分支的基因表达模式。这些图提供了基因表达变化的准时间线。值得注意的是，如分析所示，在晚期的癌组织和特定细胞簇中观察到基因表达随时间的持续下降。
接下来，对 CD8 T 细胞进行重新聚类和准时间分析，将它们分成七个不同的细胞簇（图4A）。与癌旁组织相反，簇 0,1,2 和 6 在癌组织中显着升高，表明它们在抗肿瘤免疫中的潜在作用（图 4B）。在簇 6 中观察到淋巴细胞激活基因 3 水平升高，在癌组织中高表达，以及簇 2 中甲基-CpG 结合结构域蛋白 2 表达增加。簇 1 和 0 的标志是 CD27、颗粒酶 B、CTL4A 和 PDCD1 水平升高（图 4C）。这些发现表明，癌组织中的 CD8 T 细胞可能同时表现出细胞毒性和耗尽表型，从而可能限制其在肿瘤清除方面的有效性。
CD8 T 细胞重聚类和准定时分析。A：CD8 T 细胞重聚的均匀流形近似和投影，左边是组织，右边是细胞类型;B：癌组织和癌旁组织中不同 CD8 T 细胞簇的比例;C：点图说明了标记基因在六个主要鉴定细胞簇中的平均表达水平;D：描述细胞轨迹（左上）、分化状态细胞轨迹（右上）、样本细胞轨迹（左下）和子集细胞轨迹（右下）的准时间分布的准时间分析;E：分化状态下差异基因表达的散点图;F：分支差异基因分层聚类热图。
对 CD8 T 细胞的准时间分析揭示了三个不同的分化阶段，从癌旁组织过渡到癌组织（图4D）。在分化初期，激活转录因子 3、DUSP1、DUSP2、热休克蛋白 90α家族 B 类成员 1、热休克蛋白家族 A（Hsp70）成员（HSPA）1A、HSPA1B、HSPA6、热休克蛋白家族 E 成员 1、Jun 原癌基因 AP-1 转录因子亚基、 在分化的第三阶段，前胃素表达升高（图 4E）。这一进展表明，CD8 T 细胞在从癌旁环境转变为癌变环境时发生了功能变化。这一发现可以反映它们在肿瘤免疫反应中的作用。差异基因的分层聚类在这些细胞中呈现出不同的表达状态（图 4F）。随后，确定了表达水平变化最显着的前 10 个分支。这些基因在分化轨迹上的表达模式在 I 期和随后的 II 期和 III 期之间有所不同。生成轨迹图以展示癌组织、癌旁组织和不同 CD8 T 细胞亚群不同阶段前 10 个分支内各种 DEGs 的表达模式。这些图用于描绘伪时间线，突出晚期癌组织内表达水平的下降趋势，在 II 期和 III 期尤为明显。
骨髓细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的重新聚集
鉴于上述发现，髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞在不同阶段的患者中表现出不同的比例。随后，进行了重新分类。值得注意的是，髓系细胞被分配到 11 个不同的细胞簇（图5A），内皮细胞被分配到 9 个细胞簇（图 5B），成纤维细胞被分配到 13 个细胞簇（图 5C），肌成纤维细胞被分配到 9 个细胞簇（图 5D）。这些观察结果强调了这些细胞类型在 GC 进展中的复杂参与。
骨髓细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的重新分类。 均匀流形近似和投影。A：髓系细胞;B：内皮细胞;C：成纤维细胞;D：肌成纤维细胞;重新聚类，左侧是组织，右侧是细胞类型。
在指定时期的不同时间点分析了不同细胞群之间的细胞相互作用。B 细胞在不同阶段直接与肥大细胞、骨髓细胞和中性粒细胞相互作用（图6）。值得注意的是，细胞之间的相互作用随时间而变化。具体来说，在癌旁组织的初始阶段，发现 B 细胞和肥大细胞以及其他细胞类型之间的相互作用有限。然而，随着癌症进展到 II、III 和 IV 期，B 细胞与其他细胞类型之间的相互作用显着增加。此外，骨髓细胞和中性粒细胞与其他细胞类型之间的相互作用在癌旁组织中更为频繁，而这些相互作用在癌组织中明显下降。
细胞间相互作用。 热图中的行和列分别代表各种组织样品中的不同细胞类型。颜色表示细胞间相互作用的程度，范围从蓝色 （0） 到红色 （4），值越高表示细胞间活性越强。
在这项研究中，采用 qRT-PCR 来验证 scRNA-seq 分析的结果。具体而言，对 T 细胞标记基因（CD2、CD3D 和 CD3E）和上皮细胞标记基因（KRT19、KRT8 和 EPCAM）在癌组织和癌旁组织中的表达谱进行评估。研究结果表明，相对于癌旁组织，CD2、CD3D 和 CD3E 表达在癌组织中明显受到 u 调节，同时 KRT19、KRT8 和 EPCAM 表达显着下降（图7A）。此外，采用流式细胞术定量 T 细胞和上皮细胞的数量。癌组织中 T 细胞和上皮细胞的趋势与 qRT-PCR 结果一致。结果表明，与癌旁组织相反，癌组织中的 CD2 和 CD3 细胞显着升高，并伴有 EPCAM 和 KRT19 细胞减少（图 7B 和 C）。
胃癌组织中 T 细胞和上皮细胞的趋势。A：定量实时聚合酶链反应，用于评估 T 细胞和上皮细胞的标记基因表达水平;B 和 C：流式细胞术，用于分析 T 细胞和上皮细胞标记基因的数量。aP < 0.001，b P < 0.0001 与癌旁组织相比 。
总结
总体而言，作者的 GC 单细胞图谱可以更清晰地描述肿瘤微环境与癌旁组织之间的联系，揭示 GC 发育中各种细胞的进展，并为抑制癌症发展提供了潜在的解决方案。
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