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研究共招募了 100 名参与者，包括 50 名结直肠癌（CRC）患者和 50 名健康志愿者。患者的中位年龄为 55 岁（50.0–63.75 岁），而健康志愿者的中位年龄为 52 岁（46.5–62.5 岁）。CRC 组包括 29 名男性（58%）和 21 名女性（42%），而对照组包括 18 名男性（36%）和 32 名女性（64%）。在临床特征方面，28 名患者（56%）的肿瘤主要位于结肠，而 22 名患者（44%）的肿瘤位于直肠。肿瘤位置主要在左侧，影响了 35 名患者（70%），相比之下，右侧影响了 15 名患者（30%）。肿瘤大小的分析显示，23 名患者（46%）的 CRC 肿瘤大小≤5 厘米，而 27 名患者（54%）的肿瘤大小超过 5 厘米。组织病理学分析显示，腺癌是最常见的诊断，占 45 名患者（90%），而黏液细胞癌占 5 名患者（10%）。大多数肿瘤为中至低分化，见于 44 名患者（88%），而少数肿瘤为高分化，影响了 6 名患者（12%）。 微卫星不稳定性（MSI）状态分析显示，34 个（68%）结直肠癌肿瘤为微卫星稳定（MSS），而 16 个（32%）表现出高度微卫星不稳定性（MSI-H）。临床分期显示，11 名患者（22%）处于 II 期，21 名（42%）处于 III 期，18 名（36%）处于 IV 期。在转移患者中，15 名（30%）有一个转移部位，而 4 名（8%）有两个或更多转移部位。关于转移的具体位置，8 名患者（16%）有淋巴结受累，2 名患者（4%）有肺部转移，14 名患者（28%）表现为肝脏转移。结直肠癌患者最常报告的症状包括 27 名患者（54%）的腹痛，36 名患者（72%）的便秘，以及 32 名患者（64%）的显著体重减轻。其他症状包括 13 名患者（26%）的腹泻，10 名患者（20%）的直肠出血，以及仅 1 名患者（2%）的恶心。
2.2. 结直肠癌患者与健康志愿者之间 miR-21、miR-92 和 miR-29 表达水平的比较
对三种候选 microRNA（miR-21、miR-29a 和 miR-92a）在 CRC 患者和健康志愿者血液样本中的表达水平进行了评估。为确保准确可靠的比较，使用内源性对照 miR-1228 进行了标准化。作者的结果显示，与健康对照组相比，CRC 患者的 miR-21 表达显著上调（7.42 ± 5.39 vs. 0.97 ± 0.64；p < 0.001）。类似地，CRC 患者的 miR-29a 表达水平也显著高于健康个体（9.59 ± 10.56 vs. 0.56 ± 0.38；p < 0.001）。此外，CRC 患者的 miR-92a 表达也显著上调（12.46 ± 9.22 vs. 0.61 ± 0.37；p < 0.001）。Figure 1图展示了两组中三种 miRNA 候选的表达水平。
三种候选 miRNA 在结直肠癌患者与健康对照中的表达水平。(a) miR-21 表达；(b) miR-29a 表达；(c) miR-92a 表达。组间比较采用 Mann–Whitney U 检验；*** p < 0.001。
2.3. 结直肠癌患者临床病理特征与 miR-21、miR-29a 和 miR-92a 表达的关系
作者进一步检测了三种候选 miRNA 的表达水平与结直肠癌患者临床病理特征之间的关系。作者的分析显示，miR-21 过表达与早发性结直肠癌存在显著关联，50 岁以下诊断患者的表达水平显著高于 50 岁以上诊断患者（p = 0.014）。此外，miR-21 过表达与肿瘤大小显著相关，5 厘米以上肿瘤的表达水平显著高于≤5 厘米肿瘤（p = 0.002）。此外，miR-21 过表达与临床分期进展显著相关（p = 0.001），在 IV 期患者中的表达尤为显著，显著高于 III 期患者（p < 0.05； Figure 2 a）。 miR-21 水平升高也与转移负担相关，在有两个或更多转移部位的患者中表达显著增加（p = 0.004）。此外，miR-21 过表达与淋巴结转移（p = 0.036）和肝转移（p = 0.004）相关。同样，miR-92a 表达升高与临床分期 advance 显著相关（p = 0.001），在从 II 期进展到 III 期时增加最为显著（p < 0.01）。此外，miR-92a 表达与转移负担显著相关（p < 0.002），在有两个或更多转移部位的患者中水平更高，尤其是在淋巴结转移（p = 0.015）和肝转移（p = 0.013）的患者中。此外，miR-92a 表达与结直肠癌家族史显著相关（p = 0.050），以及 CEA 水平升高（p = 0.021）。对于 miR-29a，表达水平升高与结肠肿瘤（p = 0.004）、右侧肿瘤（p = 0.035）和肿瘤直径大于 5 厘米（p = 0.036）显著相关。这些发现总结，并图示在 Figure 2 。
(a) miR-21 和(b) miR-92a 在 CRC 患者中的表达水平根据不同临床分期。ns：无显著差异；* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001。
2.4. miR-21、miR-29a 和 miR-92a 作为 CRC 生物标志物的潜在诊断价值
为评估这三个 miRNA 作为 CRC 非侵入性生物标志物的潜力，作者首先单独分析了每个 miRNA，然后评估了它们作为组合面板的整体性能。作者的 ROC 曲线分析表明，miR-21、miR-29a 和 miR-92a 的表达单独分析均能有效区分 CRC 患者和健康志愿者，提示它们作为 CRC 生物标志物的潜力。具体而言，miR-21 表现出 AUC 为 0.907（95% CI = 0.843–0.972），表明其具有良好的整体诊断能力，敏感性为 92%，特异性为 56%，阳性预测值为 67.6%，阴性预测值为 87.5%。接下来，miR-29a 的 ROC 曲线分析显示 AUC 为 0.898（95% CI = 0.832–0.964），表明其具有良好的整体诊断能力，敏感性为 76%，特异性为 94%，阳性预测值为 93%，阴性预测值为 80%。最后，miR-92a 显示出 AUC 为 0.938（95% CI = 0.880–0.995），表明其具有优异的整体诊断能力，敏感性为 88%，特异性为 90%，阳性预测值为 90%，阴性预测值为 88%。这些结果 ，并描绘在 Figure 3 a–c。
单个 miRNA 的诊断潜力 ROC 曲线分析。(a) miR-21；(b) miR-29a；(c) miR-92a。蓝线代表 ROC 曲线，而绿线对应参考线。
接下来，作者评估了三种候选 microRNA（miR-21、miR-29a 和 miR-92a）的联合检测，以确定它们的整合是否能够提高结直肠癌的诊断准确性，相比于每个 microRNA 单独检测的性能。
首先，miR-21 和 miR-29a 的联合检测显示出很强的诊断性能，AUC 为 0.944（95% CI = 0.891–0.997；p < 0.001）。当 miR-21 与 miR-92a 结合时，AUC 进一步增加到 0.966（95% CI = 0.920–1.000；p < 0.001），突出了增强的诊断能力。值得注意的是，miR-29a 和 miR-92a 的组合在所有组合中产生了最高的 AUC，达到 0.976（95% CI = 0.945–1.000；p < 0.001），表明具有更优越的诊断效率。有趣的是，三种 microRNA（miR-21、miR-29a 和 miR-92a）的联合检测结果为 AUC 0.968（95% CI = 0.923–1.000；p < 0.001），虽然非常有效，但并未超过 miR-29a 和 miR-92a 组合的性能。
ROC 曲线分析用于 CRC 诊断的三种 miRNA 组合。(a) miR-21 + miR-29a, miR-29a + miR-92a, 和 miR-21 + miR-92a; (b) miR-21 + miR-29a + 和 miR-92a。
2.5. 循环 miR-21、miR-29a 和 miR-92a 之间的相关性分析
为了研究 miR-21、miR-29a 和 miR-92a 的循环水平之间的潜在关系，进行了相关性分析。结果表明，miR-29a 与 miR-21 之间存在显著的中度正相关（r = 0.441，p = 0.001）。观察到 miR-21 与 miR-92a 之间存在弱的负相关（r = −0.300，p = 0.034）。然而，miR-29a 与 miR-92a 之间未发现显著相关性（r = −0.100，p = 0.491）。这些发现表明，miR-29a 和 miR-21 可能受到共同调控，这可能反映了 CRC 进展中共享的生物学通路或机制。相比之下，miR-29a 与 miR-92a 之间缺乏相关性表明独立调控，意味着在 CRC 中具有不同的功能作用。
2.6. In Silico 验证 miR-21、miR-92a 和 miR-29a 作为 CRC 诊断生物标志物
为了进一步验证作者的发现，作者使用 GEO 数据库的公开数据进行了外部验证（ GSE115513 ）。统计分析证实，与对照组相比，CRC 患者中 miR-21、miR-92a 和 miR-29a 的表达显著上调，p 值 < 0.001（ Figure 5 ）。
使用GSE115513 数据集比较结直肠癌患者与对照组中 3 种 miRNA 诊断生物标志物的表达水平。组间比较采用 Welch’s t 检验；*** p < 0.001。
具体而言，与对照组（6.97 ± 1.01）相比，miR-21 在结直肠癌（CRC）患者中的表达显著升高（8.39 ± 1.20，p < 0.001）。类似地，miR-92a 在 CRC 患者中的表达也显著高于对照组（6.60 ± 1.06 vs 5.45 ± 0.71，p < 0.001），而 miR-29a 在 CRC 患者中的表达同样上调（6.32 ± 1.25 vs 对照组 5.42 ± 1.01，p < 0.001）。
接下来，作者通过使用GSE115513 数据集进行 ROC 曲线分析，评估了这些 microRNA 的诊断潜力。结果表明，miR-21 表现出最高的诊断准确性，AUC 为 0.848（95% CI：0.827–0.868，p < 0.001），其次是 miR-92a（AUC = 0.833，95% CI：0.811–0.855，p < 0.001）。尽管 miR-29a 在 CRC 患者中显著升高，但其诊断性能较为温和，AUC 为 0.746（95% CI：0.720–0.772，p < 0.001）（ Figure 6 ）。作者进行了多指标 ROC 分析，以评估联合检测这些 miRNA 是否能够提高诊断准确性。同时检测 miR-21、miR-92a 和 miR-29a 获得了更高的 AUC（0.890，95% CI：0.872–0.908，p < 0.001），表明与单个 miRNA 相比，基于多指标的检测方法可能提高分类准确性。
单个 miRNA 的诊断潜力 ROC 曲线分析。(a) miR-21，(b) miR-29a，以及(c) miR-92a 在GSE115513 数据集中的 ROC 曲线。蓝线代表 ROC 曲线，而绿线则对应参考线。
为了进一步优化这些结果，作者应用了尤登指数来确定每个 microRNA 的最佳截断值。分析确定了 miR-21 的阈值为 7.57，灵敏度为 80.93%，特异性为 75.96%。同样，miR-92a 的最佳阈值为 6.01，灵敏度为 73.60%，特异性为 83.36%，而 miR-29a 的阈值为 7.56，灵敏度为 64.53%，特异性为 76.58%。
将作者的结果与GSE115513 数据集进行比较后发现，结直肠癌（CRC）患者中 miRNA 表达存在强负相关（R 2 = −0.746），而对照组个体中则观察到高度正相关（R 2 = 0.995）（ Figure 7 ）。这些发现表明，对照组中的 miRNA 表达模式在不同独立数据集中具有高度可重复性，从而增强了它们作为可靠生物标志物的潜力。相比之下，CRC 患者中观察到的差异可能受到方法学差异的影响。尽管存在这些差异，总体趋势支持 miR-21、miR-29a 和 miR-92a 在 CRC 诊断中的潜力。
作者研究人群与GSE115513 数据集之间 miRNA 表达的相关矩阵。Patients_CRC：作者研究中的 CRC 患者；Controls：作者研究中的健康个体；GSE_CRC： GSE115513 数据集中的 CRC 患者；GSE_Controls： GSE115513 数据集中的对照。
总结
这项研究强调了 miR-21、miR-29a 和 miR-92a 在结直肠癌（CRC）诊断中的潜力，其中 miR-29a 和 miR-92a 的组合（敏感性：82%，特异性：92%）被证明是最有效的诊断方法。特别是，这种组合对于高危人群（如家族史或遗传易感者）的预防筛查显示出前景。这些发现通过使用GSE115513 数据集进行的计算机模拟验证得到了进一步支持，这加强了这些 miRNA 的诊断相关性。然而，为了确认它们作为结直肠癌非侵入性生物标志物的临床适用性，仍需要在更大、更多样化的队列中进行额外验证。。
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