|
2.1. BAP31 表达升高的细胞外泌体增强受体细胞中的 EMT
为了阐明 BAP31 在结直肠癌（CRC）背景下促进 EMT 中的作用，作者在 HCT116 细胞中过表达 BAP31并收获条件培养基（CM）用于后续功能测定。Transwell 迁移测定和蛋白质印迹分析显示，来自细胞 （BAP31-OE） 的BAP31-overexpressing条件培养基 （CM） 显着促进受体细胞迁移并触发 EMT，E-钙粘蛋白减少以及 N-钙粘蛋白和波形蛋白表达增加证明了这一点。值得注意的是，从 CM 中去除外泌体消除了这种效应，表明 BAP31 对 EMT 的诱导取决于外泌体分泌（ 图 1A，B）。与这些发现一致，伤口愈合试验显示，来自细胞的BAP31-overexpressing外泌体可加速伤口闭合。定量数据证实了视觉观察，即 BAP31-OE 外泌体在 24 小时时将伤口闭合加速近 4 倍（ 图 1C 和图 S9A）。此外，共聚焦显微镜显示，与 BAP31-OE 外泌体孵育的受体细胞相对于对照组表现出 E-钙粘蛋白荧光强度的显着降低，表明上皮特征丧失。相比之下，波形蛋白在这些细胞中的表达显着升高，证实了间充质表型的获得（ 图 1D）。这些结果表明，源自细胞的BAP31-overexpressing外泌体通过下调 E-钙粘蛋白和上调波形蛋白有效地促进受体细胞中的 EMT。
源自 BAP31-OE 细胞的外泌体促进受体细胞中的 EMT。（A）Transwell 迁移测定表明，与空白组相比，用 DMEM（空白），条件培养基（CM）和 BAP31-OE 细胞的外泌体处理的受体细胞的迁移能力增加。（B）处理后受体细胞中 EMT 标志物的蛋白质印迹分析，使用 GAPDH 作为上样对照。密度分析表明，E-钙粘蛋白水平显着下降，同时 N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达升高（SEM ±平均值;*** p < 0.001，双向方差分析）。（C）伤口愈合试验表明，在 0 和 24 小时时，用 BAP31-OE 外泌体处理的细胞的间隙可以更快地闭合。（D）受体细胞中 EMT 标志物（绿色的 E-钙粘蛋白，红色的波形蛋白和 DAPI 的细胞核）的免疫荧光染色表明，BAP31-OE 外泌体促进了从上皮性状到间充质性状的转变。（E）在划痕测定中，源自 shBAP31 细胞的外泌体抑制伤口闭合，定量证实迁移减少。（F）用 shBAP31 外泌体处理的细胞中 EMT 标志物的蛋白质印迹分析显示，E-钙粘蛋白水平恢复，N-钙粘蛋白和波形蛋白表达降低（SEM±平均值;** p < 0.01，双向方差分析）。每组使用的外泌体浓度为 30 μg/mL。
为了确保成功分离外泌体，作者根据形态、大小和特定标记进行了全面的表征。透射电子显微镜（TEM）分析表明，分离的囊泡表现出特征性的杯状形态，与外泌体的预期结构一致。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，大多数颗粒的直径在 50 至 150nm 之间，支持将其鉴定为外泌体。蛋白质印迹分析证实了外泌体标记物 CD63，TSG101 和 Alix 的存在，而阴性对照（细胞裂解物）缺乏这些蛋白质，但表达高尔基体标记物 GM130。为了验证受体细胞对分离的外泌体的有效内化，作者用荧光染料 PKH67 标记外泌体，并将它们与靶细胞一起孵育。共聚焦显微镜显示 PKH67 标记的外泌体的显着摄取，表现为受体细胞细胞质中的点状绿色荧光，并被肝素钠减少，已知肝素钠会抑制外泌体摄取。这些结果共同证实了外泌体的成功分离和表征，以及它们被受体细胞的有效内化。
为了进一步证实这些发现，作者产生了 BAP31 敲低 HCT116 细胞并分离了它们的外泌体。用源自 BAP31 敲低细胞（shBAP31）的外泌体处理导致受体细胞的迁移率降低（图 1E），并对 EMT 标志物产生相反作用（图 1F）。
为了扩展作者的研究，作者利用 SW480 细胞作为受体细胞，并将它们与源自 BAP31-OE 或 shBAP31 细胞的外泌体共培养。蛋白质印迹分析表明，暴露于这些外泌体会诱导 SW480 细胞中的 EMT，上皮减少和间充质标志物增加证明了这一点。
结果验证了来自 BAP31 富集细胞的外泌体在触发 EMT 中至关重要的结论。总的来说，结果表明 BAP31 通过外泌体介导的细胞间通讯促进 CRC 中的 EMT，而其敲低则减少了对受体细胞的促转移作用。
2.2. 来自 shBAP31 细胞的外泌体抑制结直肠癌进展
为了探索这些外泌体在 CRC 进展中的功能作用，作者在裸鼠中使用 HCT116 细胞建立了皮下异种移植模型（图 2A）。与对照组相比，shBAP31 细胞的外泌体处理显著抑制了肿瘤生长，并降低了最终肿瘤体积（图 2B-D）。与此一致，在用 shBAP31 外泌体处理的小鼠中，肿瘤体重与体重之比显着降低（图 2E），表明体内具有有效的抗肿瘤活性。这些发现表明，源自 shBAP31 细胞的外泌体通过抑制 CRC 中的原发性肿瘤生长而表现出抗肿瘤作用。
源自 shBAP31 的外泌体对异种移植肿瘤模型的影响。（A）实验设计的示意图。HCT116 荷瘤小鼠从移植后第 10 天开始接受瘤内注射对照外泌体或 shBAP31 外泌体（10μg/100mm3 肿瘤，每 3 天给药一次），持续 21 天（每组 n = 6）。（B）与对照组相比，shBAP31 外泌体治疗组的肿瘤体积显着减少（SEM±平均值;** p < 0.01，双向方差分析）。（C）研究终点（第 27 天）切除肿瘤的代表性图像显示，用 shBAP31 外泌体治疗后肿瘤大小明显减小。（D）与对照组相比，shBAP31 外泌体处理组表现出显着降低的肿瘤与体重比（SEM±平均值;** p < 0.01，单因素方差分析）。（E）最终肿瘤体积的减少证实了 shBAP31 外泌体的生长抑制作用（平均±标准差;* p < 0.05，单因素方差分析）。
2.3. BAP31 在与 EMT 相关的外泌体内调节 miR-423-3p
作者的研究结果表明，通过过表达或敲低改变 BAP31 表达水平不会显着影响外泌体的粒径或生产量。考虑到外泌体摄取后受体细胞中 EMT 的快速起现，作者假设外泌体 miRNA 可能充当主要信号介质。为了探索这一假设，作者使用来自对照细胞的外泌体作为阴性对照，对源自细胞的BAP31-overexpressing外泌体进行了 miRNA 分析。miRNA 测序数据由联川生物科技有限公司（中国杭州）提供。原始测序数据已存入 BioProject 数据库，登录号为 PRJNA884845。与对照组相比，比较分析在细胞外BAP31-overexpressing泌体中鉴定出 41 个上调和 35 个下调的 miRNA（图 3A）。
BAP31 对外泌体 miR-423-3p 的影响，促进 EMT 和肿瘤在体外和体内的进展。（A）miRNA 分析分析鉴定出 76 个 miRNA 在 BAP31-BAP31-OE 细胞来源的外泌体中表达差异，其中上调的 miRNA 显示为红色，下调的 miRNA 显示为蓝色。（B）采用定量逆转录 PCR（qRT-PCR）检测 BAP31-OE 外泌体中不同外泌体 miRNA 的表达水平。结果显示为平均值±标准差，样本量为 n = 3。使用学生 t 检验评估统计显着性，与对照组相比，* p < 0.05。（C）qRT-PCR 分析证实了 shBAP31 外泌体中的外泌体 miRNA 水平，以平均值±标准差（n = 3）表示，使用学生 t 检验确定统计学显着性（* p < 0.05 与对照组相比）。（D）CCK-8 测定表明，50 nM miR-423-3p 模拟物在 48 和 72 小时显着增强了 HCT116 细胞活力（** p < 0.01，与 mi-Con 相比，通过双向方差分析）。统计显着性标记是指在最终时间点（72 小时）的比较（E）细胞中 miR-423-3p-treated EMT 标记物的蛋白质印迹分析显示 E-钙粘蛋白降低，N-钙粘蛋白和波形蛋白水平升高，定量显示在右图中（平均值 ± SD，n = 3;** p < 0.01，单因素方差分析）。（F）伤口愈合试验证实 miR-423-3p 在 0 小时和 24 小时增强细胞迁移。 右侧面板中的统计分析。** p < 0.01。（G）在异种移植模型中，与对照组相比，miR-423-3p 模拟组的肿瘤显着增加（* p < 0.05，** p < 0.01，n = 6）。
作者分析了 GEO 数据库中的 GSE136194 miRNA 数据集，以识别受 BAP31 影响的 EMT 相关 miRNA，在 30 个样本中揭示了 177 个与 EMT 相关的非编码基因。通过将它们与 BAP31 调节的外泌体 miRNA 相交，作者选择了六个高表达的候选药物（hsa-miR-122-5p_R-1has-miR-423-3p、has-miR-31-5p、has-miR-146a-5p、has-miR-223-3p 和 has-let-7d-3p）进行进一步验证。定量逆转录 PCR（qRT-PCR）分析证实了 BAP31-OE 外泌体中 has-miR-423-3p 和 has-miR-31-5p 的hsa-miR-122-5p_R-1上调，以及 has-let-7d-3p 的下调，如图 3B 所示，与 miRNA 分析获得的结果一致。
相反，shBAP31 外泌体的 qRT-PCR 分析显示相反的表达模式;hsa-miR-122-5p_R-1 和 has-miR-423-3p 下调，而 has-let-7d-3p 上调，如图 3C 所示。在受体细胞中使用 miRNA 模拟物和抑制剂的功能测定表明，miR-423-3p 显着增强细胞增殖，降低 E-钙粘蛋白表达（上皮标志物），并增加 N-钙粘蛋白和波形蛋白水平（间充质标志物），表明 EMT 诱导，如图 3D，E 所示。相比之下，hsa-miR-122-5p_R-1 和 has-let-7d-3p 没有表现出显着的效果。此外，对用 miR-423-3p 模拟物处理的受体细胞进行的伤口愈合测定显示，细胞迁移显着增强，加强了其在促进 EMT 方面的作用，如图 3F 所示。在异种移植肿瘤模型中，瘤周注射 miR-423-3p 模拟显着增强肿瘤生长，进一步证实了其效果（图 3G）。这些发现证实，受 BAP31 调节的外泌体 miR-423-3p 对于促进 EMT 和肿瘤进展至关重要。
2.4. miR-423-3p 通过与 BIM 的相互作用增强 EMT
利用 miRDB、TargetScan 和 miRTarBase 进行的生物信息学分析揭示了 miR-423-3p 的 16 个潜在靶基因，编码 RAP2C、PLCH1、BCORL1、PABPC3、PABPC1、LGALSL、RAB14、FGFR2、Bim、ITGA11、DKK3、CRK、TRDN、SLC11A2、ZNF16 和 CALML3 等蛋白（图 4A）。作者使用酶联免疫吸附测定（ELISA） 来评估用BAP31-overexpressing外泌体处理或用 miR-423-3p 模拟物转染的细胞中的蛋白质表达变化，评估对这些靶标的调节作用。值得注意的是，Bim 对这两种干预措施都表现出最明显和一致的反应（图 4B）。随后的蛋白质印迹分析进一步证实，miR-423-3p 显着调节 Bim 蛋白水平（图 4C，D）。此外，定量逆转录 PCR（qRT-PCR）显示，所有 CRC 细胞系的 miR-423-3p 下调 Bim mRNA。荧光素酶报告基因测定证实，miR-423-3p 直接与 Bim 的 3’非翻译区（UTR）相互作用（图 4E）。用 siRNA 沉默 Bim 提高了受 miR-423-3p 影响的细胞的增殖率（图 4F）。上皮标志物 E-钙粘蛋白上调，而间充质标志物 N-钙粘蛋白和波形蛋白下调（图 4G），表明 miR-423-3p/Bim 轴可能在 EMT 调节中发挥作用。总之，这些发现表明 Bim 是 miR-423-3p 的直接且功能上重要的靶标，从而影响其对 CRC 细胞增殖和 EMT 动力学的调节作用。
miR-423-3p 通过直接靶向 Bim 促进 EMT 的进展。（A）使用 TargetScan，miRDB 和 miRTarBase 通过生物信息学预测生成的示意图。（B）ELISA 分析显示，暴露于 BAP31-OE 外泌体或 miR-423-3p 模拟物（50 nM，48 小时）的细胞（B）中 Bim 表达显着降低，与对照组相比，* p < 0.05 ** p < 0.01 *** p < 0.001，由单因素方差分析确定。（C）蛋白质印迹分析证实了 miR-423-3p 模拟物对 Bim 的下调（48 小时）。（D）用 miR-423-3p 抑制剂处理后观察到 Bim 表达的反向增加（48 小时）。（E）双荧光素酶测定表明，miR-423-3p 直接与野生型（WT）Bim 3’UTR 结合，而与突变体（MUT）3’UTR 没有结合（** p < 0.01 与 mi-Con 相比，双向方差分析）。（F）CCK-8 测定表明，当与 Bim siRNA 共转染 48 小时时，miR-423-3p 的促生存作用降低（** p < 0.01 与 si NC 相比）。统计显着性标记是指在最终时间点（72 小时）的比较。（G）蛋白质印迹分析表明，Bim siRNA 处理可miR-423-3p-induced逆转 EMT，如 E-钙粘蛋白水平升高以及 N-钙粘蛋白和波形蛋白表达降低所示。
2.5. BAP31 通过调节 alyref 促进 miR-423-3p 在外泌体中的选择性富集
BAP31 的过表达或敲低对外泌体中 miRNA 的总水平没有显着影响，表明 BAP31 可能不会在调节整体 miRNA 含量中发挥作用。作者假设 BAP31 可能参与 miRNA 选择性加载到外泌体中。值得注意的是，作者发现 miR-423-3p 具有 EXOmotif（GGCCCC），这是一种特定的序列基序，有助于将 miRNA 分选为外泌体[16]。此外，对源自细胞的BAP31-overexpressing外泌体的 miRNA 分析表明，含有该 EXOmotif 的另外三个 miRNA（has-mir-10396b-p3、has-mir-10396a-p3 和 PC-3p-105562_4）也被上调。为了阐明潜在机制，作者研究了 RNA 输出衔接体 Alyref 和 Fus，它们已知可以识别 EXOmotifs 并介导 miRNA 加载到外泌体中。
RNA 免疫沉淀（RIP）测定显示，miR-423-3p 在过表达 BAP31 的细胞中选择性地与 Alyref 结合（图 5A，B），而未观察到与 Fus 的相互作用。qRT-PCR 和蛋白质印迹分析显示，Alyref 表达随着 BAP31 过表达而增加，随着 BAP31 敲低而降低（图 5C-F）。结果表明，BAP31 调节 Alyref 表达，影响 miR-423-3p 与外泌体的整合。这种机制可能解释了观察到的特定 miRNA 在 BAP31 调节的外泌体中富集的原因。
BAP31 通过调节 Alyref 促进 miR-423-3p 在外泌体中的选择性富集。（A）在（BAP31-OE） 细胞中使用BAP31-overexpressing抗 Alyref 抗体进行的 RNA 免疫沉淀 （RIP） 分析表明，与 IgG 对照相比，ALYREF-RIP 样品中 miR-423-3p 显着富集，如 qRT-PCR 确定（归一化为输入;平均 ± SD，*** p < 0.001，n = 3;通过学生 t 检验分析）。（B）在转染野生型或突变型 ALYREF 的 HCT116 细胞中进行的 RIP 测定通过 qRT-PCR 显示，该突变显着降低了 ALYREF 对 miR-423-3p 的结合亲和力（平均值 ± SD，学生 t 检验，** p < 0.01）。（C）定量逆转录 PCR（qRT-PCR）分析显示，与对照组相比，BAP31-OE 细胞中的 ALYREF mRNA 水平显着增加（平均±SD，n = 3，学生 t 检验，** p < 0.01）。（D）蛋白质印迹分析证实了 BAP31 过表达 48 小时后 Alyref 的上调。（E）定量逆转录 PCR （qRT-PCR） 证实 BAP31-OE 细胞中 ALYREF mRNA 水平升高（平均 ± SD，n = 3，学生 t 检验，** p < 0.01 与对照相比）。（F）蛋白质印迹分析表明，在 48 hBAP31 敲低后，Alyref 下调。
总结
总之，作者对 BAP31 在调节外泌体 miRNA 含量中的作用及其对 EMT 和 CRC 进展的影响提供了重要的见解。研究结果强调了 miR-423-3p 及其靶标 Bim 在介导 BAP31 对 CRC 进展的影响中的关键作用。这些发现加深了作者对 CRC 进展分子机制的理解，并为开发针对 CRC 中 EMT 的新治疗策略提供了潜在途径。需要额外的机制和临床研究来将这些见解发展为有效的治疗方法。
|
