脑卒中，作为成年人死亡与永久残疾的首要诱因之一，其中缺血性脑卒中占比超80%，给患者家庭和社会带来沉重负担。
目前，组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是急性缺血性脑卒中的主要药物，但它存在3-4.5小时的狭窄治疗窗口，且血脑屏障破坏会增加出血风险，严重限制了其疗效。
血脑屏障是维持中枢神经系统稳态的关键物理与生化屏障，它能精准调控血液与脑组织间的物质交换。然而，在缺血性脑卒中发生时，血脑屏障极易受损，导致血液成分外渗，破坏神经元正常功能，进而引发脑损伤和神经功能障碍。
因此，寻找保护血脑屏障免受缺血性脑卒中损伤的新策略，成为医学领域亟待解决的重要课题。
新兴的3D球体模型能更好地模拟血脑屏障的内皮极化和转运体表达模式，为研究神经血管单元（NVU）提供了理想的体外模型。
冠心宁注射液（GXNI）是由丹参和川芎提取物组成的中药注射剂，此前研究已证实其在改善心肌缺血再灌注损伤等方面具有显著作用，但它能否通过保护血脑屏障来减轻脑缺血再灌注（I/R）损伤，尚不明确。
基于此，研究团队开展了一系列实验，旨在探究冠心宁注射液对缺血性脑卒中诱导的血脑屏障破坏的保护作用及机制，为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路和实验依据。
研究团队首先构建了由人脑微血管内皮细胞、人星形胶质细胞和原代人脑微血管周细胞组成的3D血脑屏障类器官，并建立了模拟缺血性脑卒中的氧糖剥夺/复氧（OGD/R）条件。
通过形态学观察、旁细胞通透性检测以及紧密连接蛋白表达分析，评估体外血脑屏障的结构和功能。
在体内实验中，利用大脑中动脉闭塞诱导的脑缺血再灌注损伤模型，检测梗死体积和血脑屏障渗漏情况。借助RNA测序和网络药理学分析，筛选出缺血性血脑屏障破坏的关键基因和通路。
通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对冠心宁注射液中的活性成分进行鉴定和定量分析。同时，运用分子对接、表面等离子体共振和分子动力学模拟，预测并验证活性化合物与靶蛋白的相互作用。
研究还通过细胞活力检测、免疫荧光染色、qPCR、Western blot等多种实验技术，从细胞、分子和动物水平全面验证冠心宁注射液及其活性成分对血脑屏障的保护作用和机制。
一、冠心宁注射液改善3D血脑屏障类器官功能与结构
在OGD/R诱导的3D血脑屏障类器官模型中，研究发现OGD/R处理显著降低了细胞活力，破坏了类器官的结构完整性，导致表面面积、体积、球形度等参数显著下降。
而给予不同浓度的冠心宁注射液（1、3、10 μL/mL）处理后，细胞活力明显提升，类器官的结构损伤得到显著改善，各项形态学参数均向正常水平恢复，且效果与阳性对照药依达拉奉（EDA）相当（图1A）。
图1
进一步研究发现，OGD/R处理导致血脑屏障类器官的旁细胞通透性显著增加。冠心宁注射液预处理能有效抑制这种通透性增加，减少葡聚糖的渗漏，表明其可增强血脑屏障的完整性。
紧密连接蛋白对于维持血脑屏障的屏障功能至关重要。OGD/R处理使紧密连接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin的表达水平下降。而冠心宁注射液处理后，这些紧密连接蛋白的表达水平显著上调（图1D-F），有力地证明了冠心宁注射液对紧密连接结构的保护作用。
图1
二、冠心宁注射液调节血脑屏障关键功能蛋白与抗氧化
P-糖蛋白（P-gp）是血脑屏障内皮细胞腔面的重要转运蛋白，对维持脑内药物浓度和内环境稳定具有重要意义。
OGD/R处理后，血脑屏障类器官中P-gp的功能显著下降，其底物罗丹明123（Rh123）的内流增加，P-gp的表达水平下降（图2A-B）。冠心宁注射液处理可有效恢复P-gp的功能，同时上调P-gp的表达水平。
图2
基底膜的主要成分层粘连蛋白（laminin）和Ⅳ型胶原在维持血脑屏障完整性方面发挥关键作用。OGD/R处理导致层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的表达水平下降（图2F）。冠心宁注射液处理能够显著逆转这种下降趋势，有效保护了基底膜的结构完整性。
图2
氧化应激（ROS）在缺血性脑卒中引发的脑损伤中扮演重要角色。OGD/R处理使血脑屏障类器官中的ROS水平显著升高。而冠心宁注射液预处理可显著降低ROS水平，表明冠心宁注射液具有良好的抗氧化作用，能减轻氧化应激对血脑屏障的损伤。
三、冠心宁注射液调控TLR4/NF-κB/MMP9神经炎症通路
通过RNA测序和网络药理学分析，研究团队筛选出102个与血脑屏障相关的差异表达基因（DEG），其中36个上调，66个下调。
通路分析显示，动脉粥样硬化信号通路、神经炎症信号通路和IL-15生成是排名前三的经典信号通路，而细胞间信号与相互作用、神经系统疾病和机体存活是主要的疾病和功能类别。
进一步的通路-通路相互作用分析表明，基质金属蛋白酶9（MMP9）参与了前10条通路中的7条，是神经炎症信号通路中最可能的候选靶点。Toll样受体4（TLR4）基因在上调因子中排名靠前。
免疫荧光和qPCR实验证实，OGD/R处理显著上调了血脑屏障类器官中TLR4、NF-κB和MMP9的表达水平，且NF-κB的核转位明显增强。
冠心宁注射液处理可显著降低TLR4和MMP9的表达水平，同时抑制NF-κB的核转位，其效果与TLR4抑制剂TAK-242相似（图3A）。
图3
为进一步验证MMP9在冠心宁注射液保护血脑屏障中的作用，研究使用了特异性MMP9抑制剂SB-3CT。结果显示，OGD/R处理使层粘连蛋白、occludin和ZO-1的表达降低。
冠心宁注射液和SB-3CT处理均能显著上调这些蛋白的表达，且冠心宁注射液联合SB-3CT处理的效果更为显著，表明冠心宁注射液可能通过抑制MMP9来保护血脑屏障的完整性。
图3
四、冠心宁注射液活性成分的筛选与验证
通过分子对接筛选，研究发现冠心宁注射液中丹参来源的丹酚酸B（SAB）和川芎来源的藁本内酯I（SI）与MMP9具有较高的结合亲和力。
SPR实验结果表明，丹酚酸B与MMP9的结合具有剂量依赖性，表明两者具有较强的结合能力。
分子动力学模拟显示，丹酚酸B-MMP9复合物在模拟过程中保持稳定，且形成了4-5个氢键，进一步证实了丹酚酸B与MMP9的稳定结合。
五、丹酚酸B与藁本内酯I协同保护血脑屏障
研究发现，丹酚酸B和藁本内酯I单独处理均能上调OGD/R损伤后的血脑屏障类器官中紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达，下调MMP9的表达。
而丹酚酸B与藁本内酯I联合处理时，对紧密连接蛋白的上调作用和对MMP9的下调作用更为显著，其效果接近MMP9抑制剂SB-3CT，表明丹酚酸B和藁本内酯I在保护血脑屏障方面具有协同作用。
六、冠心宁注射液在动物模型中的保护作用
在大脑中动脉闭塞诱导的脑缺血再灌注损伤（CIRI）小鼠模型中，TTC染色结果显示，CIRI导致小鼠脑梗死体积显著增加（图4A-C）。
冠心宁注射液（2.5、5、10 mL/kg）处理能显著减少脑梗死体积，效果与阳性对照药依达拉奉相近。同时，冠心宁注射液还能显著改善小鼠的神经功能缺损评分，减轻神经功能障碍。
Evans蓝渗漏实验表明，CIRI导致小鼠血脑屏障通透性显著增加。冠心宁注射液处理可显著降低血脑屏障通透性，减少Evans蓝渗漏，表明冠心宁注射液在体内能有效保护血脑屏障的完整性。
图4
Western blotting和免疫荧光实验结果显示，CIRI显著上调小鼠脑组织中TLR4、p-NF-κB和MMP9的表达水平。冠心宁注射液处理可显著下调这些蛋白的表达，进一步证实了冠心宁注射液通过调控TLR4/NF-κB/MMP9神经炎症通路保护血脑屏障的机制。
本研究通过体外3D血脑屏障类器官模型和体内脑缺血再灌注损伤小鼠模型，系统阐明了冠心宁注射液对缺血性脑卒中诱导的血脑屏障破坏的保护作用及机制。
研究证实，神经炎症是缺血性血脑屏障损伤的核心驱动因素，而冠心宁注射液可通过靶向TLR4/NF-κB/MMP9信号通路，减轻神经炎症反应，从而保护血脑屏障的完整性。
在体外实验中，冠心宁注射液能提高OGD/R损伤后的血脑屏障类器官细胞活力，降低旁细胞通透性，上调紧密连接蛋白、基底膜成分和转运蛋白P-gp的表达，同时减少ROS生成。
在体内实验中，冠心宁注射液可减少脑缺血再灌注损伤小鼠的脑梗死体积，降低血脑屏障渗漏，改善神经功能缺损，并下调TLR4、p-NF-κB和MMP9的表达。
此外，研究还发现冠心宁注射液中的活性成分丹酚酸B和藁本内酯I可协同作用，通过与MMP9结合，抑制其活性，进而增强对血脑屏障的保护效果。
这些研究结果不仅为冠心宁注射液在缺血性脑卒中治疗中的应用提供了充分的实验依据，也为从中药中筛选血脑屏障保护剂以及开发多成分协同作用的治疗药物提供了新的思路。
未来，可进一步开展临床研究，验证冠心宁注射液在缺血性脑卒中患者中的疗效和安全性，同时深入探索丹酚酸B和藁本内酯I协同保护血脑屏障的分子机制，为缺血性脑卒中的治疗开辟新的途径。
参考文献：
Fan S, Du H, Yao Y, Wang H, Zhang M, Shi X, Yan J, Peng L, Xiao G, He S, Lyu M, Zhu Y. Protection against stroke-induced blood-brain barrier disruption by Guanxinning injection and its active-component combination via TLR4/NF-κB/MMP9-mediated neuroinflammation. Phytomedicine. 2025 Nov;147:157162. doi: 10.1016/j.phymed.2025.157162.