随着个体化医学的发展和“精准医疗”概念的提出，肿瘤基因检测发展迅速，临床研究逐渐发现并证实更多与肿瘤药物疗效相关的基因突变。传统的基因突变检测方法如Sanger测序、实时荧光PCR等仅能对单个基因，或者单个基因的部分外显子突变进行检测，需要的样本量大，检测时间长。高通量测序（NGS），能够同时对上百万甚至数十亿个DNA片段分子进行测序，可实现在较低的成本下，一次对上百个肿瘤相关基因、全外显子以及全基因组进行检测，而且需要的样本量并不会增加。由于在通量、成本和效率方面的优势，NGS技术在肿瘤基因突变检测中展现出广阔的应用前景。
肿瘤（tumor）或者说癌（cancer），可以理解为生物体内细胞之间的竞争性演化的结果。DNA 的复制不是100%正确，以及在外界因素的影响下（比如阳光中的紫外线），机体的各个细胞都在持续不断地产生变异。这些变异不是与生俱来的，基本都不能遗传给下一代（生殖细胞的变异可以），被称为体细胞变异（somatic mutation）。某些特定的变异会让细胞产生更强的竞争力和繁殖力，最终突破本身所处的微环境的限制，入侵到其他的组织或者转移到其他的位置，就形成了肿瘤。这只是一个概括性的描述，事实上，肿瘤的形成是一个相当复杂的生物学过程。
肿瘤组织是有异质性（heterogeneity）的，即肿瘤组织中的不同细胞，DNA序列不完全一致，基因表达水平不完全一致。其中包含不同的亚克隆（subclone），也包含健康的组织细胞。高通量测序（NGS）恰好可以克服这个难题，因为测序时都是针对单个分子进行，可以准确检测来自不同细胞的DNA的序列。在检测肿瘤组织的变异时，需要使用该样本对应的正常组织，来过滤掉个体自身携带的胚系变异。
采用高通量测序进行肿瘤基因突变检测的实验技术策略主要有3种：全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）和靶向测序（Targeted Sequencing），主要检测的变异类型包括单核苷酸变异（SNV）、小片段插入缺失（Indel）、拷贝数变异（CNV）和结构变异（SV）。其中，靶向测序目前在临床的应用最为广泛，WES其实也属于靶向测序的一种，但覆盖的是基因组上所有外显子区域，采用的是探针杂交捕获方法，另外一种常用方法是多重PCR扩增子测序方法。
探针杂交捕获和多重PCR扩增两种方法各有优势和不足。多重PCR扩增操作相对简单、检测周期较短、数据利用率也比较高。不足之处：①对于未知的融合基因变异其双端引物难以设计；②不同引物扩增效率的差异会对CNV的检测造成较大影响；③在引物结合位置的突变无法有效检出。探针杂交捕获在以上3个方面均有一定优势，但也存在一些缺点:①流程相对复杂，检测周期较长；2由于非特异性捕获非区域序列，数据利用率相对较低。
TMB（tumor mutation burden，肿瘤变异负荷）是一个比较新的肿瘤标志物，TMB的意义是评估肿瘤产生新的蛋白质（这可以引发机体免疫系统产生对肿瘤细胞的免疫杀伤作用）的可能性。TMB的检测原理是统计肿瘤组织中的体细胞变异的数量，新变异越多，则产生新的蛋白质的可能性越大，这些新的蛋白质被呈递到细胞表面、被免疫系统识别为“异己”（即新抗原，neoantigen）的机会就越大。因此，TMB数值更大的患者（TMB-H）更容易从免疫治疗中受益。采用靶向捕获测序检测TMB时，不同癌种TMB-H 的标准是不同的，即使是同一个检测panel，同一个癌种，不同的检测范围，TMB-H 的标准也不同。TMB算法和阈值区分目前国内外尚未形成统一标准。
人基因组中有多套应对 DNA 损伤的修复方案，其中一种是利用同源染色体作为模板来修复损伤的 DNA。这套修复方案被称为同源重组修复（homologous recombinational repair，HRR）。如果这套DNA 修复的功能发生异常（homologous recombinational deficiency，HRD），就会导致细胞的自我修复能力下降，进而导致死亡。在肿瘤的治疗方面，HRD 的存在，可以和一些药物产生“合成致死”效应，从而杀灭肿瘤细胞。
确定肿瘤中是否存在 HRD，有两个方向的方法可以选择。第一种是检测 HRR 通路相关的功能基因是否存在功能缺陷。虽然目前已有研究证实若干基因参与 HRR 通路，但是仍不完整。典型代表基因是BRCA1/2。第二种方法是检测 HRD 在基因组上留下的痕迹。由于修复功能出现故障，所以基因组上会留下无法修复的变异，称之为“基因组瘢痕（genomic scars）”，包括三种:基因组杂合性缺失（loss ofheterozygosity，LOH）、端粒等位基因不平衡（telomeric alelic imbalance，TAI）、大片段迁移（large-scale state transition， LST）。具体的检测方法有多种，主要是通过在全基因组范围内检测SNP来实现。
MSI 指的是微卫星不稳定（Microsatellite instability）。微卫星 DNA（Microsatellite DNA）是基因组上的一种串联重复序列，每个重复单元为 1-6个碱基，重复次数不等。微卫星 DNA 是一种多态性极高的序列，可以作为个体的分子身份证，用于个体的识别。多态性的产生和复制有关，当新合成的 DNA 链和模板链产生解离又重新结合时，会有一定概率结合在错误的位置造成其长度的改变，微卫星 DNA 是串联重复序列，新合成链和模板链的结合容易跨越多个重复单元，出现新的微卫星等位基因现象。针对 MSI的检测，在早期是采用 PCR+毛细管电泳的方式，这也是 MSI 检测的金标准，另外可以采用基于靶向测序的 MSI 检测方法。
上述3种标志物都是治疗性标志物，可以指导临床是否使用相关类型的治疗药物。而MRD 是随访诊断性质的标志物。MRD 可以有多种解释，如分子残留病灶（molecular residuadisease）、微小残留病灶（minimal residual disease）或可测量残留病灶（measurable residual disease）。总之MRD是指经过治疗后，体内残存的少量肿瘤细胞。
MRD的检测，主要是通过外周血里的肿瘤相关成分进行，比如ctDNA（循环肿瘤 DNA）或者CTC（循环肿瘤细胞）这种直接来源于肿瘤组织的信号，或者相关免疫细胞这种间接信号。MRD 检测的意义在于，如果持续是阴性的结果，则肿瘤组织足够小或者没有，不用担心复发的风险；如果检测结果是阳性说明肿瘤组织仍然存在，而且已经释放一定的物质进入血液或者引发一定强度的免疫反应。MRD 的检测可以采用个体化定制panel，非常灵敏，可以提前若干个月检测到肿瘤病灶的存在，为将来的持续监测和治疗提供依据。
随着临床多基因检测需求的增加，使得NGS靶向测序在肿瘤诊断治疗中有较好的临床应用价值。肿瘤标志物的检测，在肿瘤诊疗中可以分析TMB、HRD和MSI，这三个肿瘤标志物可以检测几百个基因的CDS区、全基因组SNP 和少量的STR区域，而MRD 在临床上监测肿瘤复发的价值已经得到验证。随着发展，新的生物标志物将不断出现，新的NGS测序技术不断进入临床检测，NGS技术在肿瘤的精准诊疗中将发挥更加重要的作用。
肿瘤精准诊疗检测技术及特点
肿瘤的发病机制与精准诊疗
|