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从 TCGA 数据库中鉴定出具有预后意义的自噬相关 lncRNA
通过单变量 Cox 回归分析和 Kaplan–Meier (K-M)生存测试，从 TCGA 数据库中鉴定出八种与自噬相关的 lncRNA，基于其显著的预后相关性。鉴定的 lncRNA 包括 LINC01138、TMEM220-AS1、NRAV、ZFPM2-AS1、MIR210HG、AC009779.2 、AL031985.3 和 AC015908.3 。随后，应用 Akaike 信息准则（AIC）进行筛选，分离出 AIC 值最低的五种 lncRNA。这些 lncRNA LINC01138、TMEM220-AS1、MIR210HG、AL031985.3 和 AC015908.3 ，通过多变量 Cox 回归分析被鉴定为构建预后模型的关键候选者。
为这五种 lncRNA 生成了生存曲线和相应的 p 值（图1 A–E），揭示了 lncRNA 表达水平与患者生存结果之间存在显著关联。此外，使用受试者工作特征（ROC）分析的曲线下面积（AUC）值评估了基于 lncRNA 模型的预测准确性。预后评分的 AUC 为 0.761，超过了传统临床参数：年龄（AUC 0.511）、性别（AUC 0.504）、等级（AUC 0.478）、分期（AUC 0.703）、T 分期（AUC 0.708）、M 分期（AUC 0.508）和 N 分期（AUC 0.508）。这些结果表明，该模型对患者生存的预测能力超过了传统临床特征（图 1 F）。
AAC015908.3 的生存曲线。 B AL031985.3 的生存曲线。 C LINC01138 的生存曲线。 D MIR210HG 的生存曲线。 E TMEM220-AS1 的生存曲线。 F 模型的 ROC 曲线。 G 风险值呈持续上升趋势。 H 生存时间。随着风险值的增加，死亡人数也逐渐增加。 I lncRNA 表达水平
在肝细胞癌中，五个自噬相关 lncRNA（LINC01138、TMEM220-AS1、MIR210HG、AL031985.3 和AC015908.3 ）表现出独特的表达模式。需要注意的是，这些 lncRNA 的功能可能因癌症类型而异，在某些癌症中作为致癌因子，而在其他癌症中作为抑癌因子。由于这种差异性，作者的分析特别关注它们在肝细胞癌中的预测标记作用，而不假设它们在不同癌症中具有一致的功能行为。
根据自噬相关长链非编码 RNA 的预后特征得出的风险评分的中位数，将肝细胞癌患者分为高风险组和低风险组。Kaplan–Meier 生存分析显示，与低风险组相比，高风险组患者的总生存期（OS）明显更短（图1 G）。风险评分较高的患者生存时间更短（图 1 H）。此外，热图揭示了高风险和低风险肝细胞癌患者之间与预测模式相关的五种长链非编码 RNA 数量的明显差异（图 1 I）。
与自噬相关的长链非编码 RNA 模型及其临床病理特征
通过分层分析评估了自噬相关长链非编码 RNA（lncRNA）的预后价值，根据各种临床病理特征对患者进行分组。如图2 A 所示，森林图显示了包括年龄、性别、等级、肿瘤分期（分期）、T 分期、M 分期、N 分期和基于 lncRNA 的风险评分等指标的 hazard 比值和 p 值。分析显示 T 分期和风险评分与患者预后存在显著关联（P = 0.005）。图 2 B 进一步展示了基于 lncRNA 的风险评分在不同临床亚组中的 hazard 比值分布，观察到晚期患者的比值更高。
A, B 独立预后分析结果。C lncRNA MIR210HG 的表达。D siRNA 的敲低效率。E 克隆形成结果。F 克隆形成统计结果。G 使用雷帕霉素的克隆形成结果。H 使用雷帕霉素的克隆形成统计结果。I 细胞增殖的 CCK8 检测结果。J 使用雷帕霉素的细胞增殖 CCK8 检测结果。K 流式细胞术检测的细胞凋亡结果。L 流式细胞术统计数据。M 流式细胞术检测的凋亡相关蛋白 Bax 和 BCL2 的 Western blot 结果。N Bax 的统计结果。O BCL2 的统计结果。P 细胞周期蛋白 CyclinD1 的 Western blot 检测结果。Q CyclinD1 的统计结果。
与正常肝细胞 LO2 相比，肝癌细胞系中 lncRNA MIR210HG 的表达水平显著升高。本研究中使用的实验细胞为 Huh7 细胞，与其他三种肝癌细胞系（Hep1、Hep3B、MHCC97-H）相比，Huh7 细胞的 lncRNA MIR210HG 表达水平最高（图2 C）。由于 Huh7 细胞表达最高、重复性最好且对自噬的反应最强，因此最终选择 Huh7 细胞。为有效敲低 MIR210HG，设计并合成了三段特异性靶向 MIR210HG 的 siRNA。单独测试每段 siRNA，并通过 qRT-PCR 评估转染后 MIR210HG 的表达水平，以确定其敲低效率。选择敲低效率最高的 si-RNA1 进行后续实验（图 2 D）。随后建立了三组：si-MIR210HG 组、si-NC 组和空白对照组。为评估 MIR210HG 对细胞增殖的影响，使用 Huh7 细胞进行了 CCK8 和克隆形成实验。 克隆形成实验表明，与 si-NC 对照组相比，si-MIR210HG 转染组的集落形成能力显著下降，这表明 MIR210HG 敲低显著抑制了细胞增殖（图 2 E, F）。在雷帕霉素处理后，转染细胞的集落形成能力得到恢复（图 2 G, H）。类似地，CCK8 实验显示，与 si-NC 对照组相比，si-MIR210HG 转染组的细胞增殖显著减少，进一步支持了 MIR210HG 敲低对细胞生长的抑制作用（图 2 I）。添加雷帕霉素成功恢复了转染细胞的增殖能力（图 2 J）。
沉默长链非编码 RNA MIR210HG 促进肝细胞癌细胞的凋亡
采用 Annexin VFITC/PI 双染流式细胞术，评估 lncRNA MIR210HG 敲低对细胞凋亡的影响，以验证实验结果。在沉默 lncRNA MIR210HG 后，实验结果显示凋亡细胞比例显著上升（图2 K, L）。通过 Western blot 检测凋亡相关的重要蛋白 Bax 和 BCL2（图 2 M）。与对照组相比，lncRNA MIR210HG 的减少导致 Bax 表达水平显著升高，BCL2 表达水平显著降低（图 2 N, O）。本研究结果证实 lncRNA MIR210HG 在 Huh7 细胞中诱导细胞凋亡。
沉默 lncRNA MIR210HG 可以抑制肝细胞癌细胞的周期
周期蛋白 D1 是细胞周期 G1 期的一个关键调节蛋白，传统上与 CDK4/6 蛋白形成复合物。该复合物促进细胞周期进程。Western blot 分析先前表明，在 Huh7-siRNA 处理组中，尽管处理条件相同，周期蛋白 D1 蛋白表达水平与对照组相比显著降低（图2 P, Q）。这种降低表明 Huh7 细胞中细胞周期进程受到抑制，这是由于 Huh7-siRNA 的干预所致。
通过沉默长链非编码 RNA MIR210HG 可以抑制肝细胞癌细胞的迁移和侵袭
肿瘤的进展和扩散通常依赖于浸润和运动，这是癌细胞的一个关键特性。Transwell 侵袭实验的结果表明，与对照细胞相比，转染的 si-MIR210HG 细胞表现出显著降低的移动性（图3 A, B）。在转染细胞中加入雷帕霉素后，Huh7 细胞的侵袭能力得到恢复（图 3 C, D）。划痕实验也得到了类似的结果（图 3 E, F）。在转染细胞中加入雷帕霉素后，Huh7 细胞的迁移能力得到恢复（图 3 G, H）。结果表明，抑制长链非编码 RNA MIR210HG 可以阻碍 Huh7 细胞的迁移。
A 穿透和迁移的结果。B 穿透和迁移的统计结果。C 使用雷帕霉素的穿透和迁移的统计结果。D 使用雷帕霉素的穿透和迁移结果。E 划痕实验结果。F 划痕实验的统计结果。G 使用雷帕霉素的划痕实验的统计结果。H 使用雷帕霉素的划痕实验结果。I、J 裸鼠肿瘤形成结果。K 肿瘤组织中自噬相关蛋白 LC3B 和 P62 的 Western blot 检测结果。L LC3B 的统计结果。M P62 的统计结果。N 肿瘤组织中信号通路蛋白 mTOR 和 p-mTOR 的 Western blot 检测结果。O mTOR 的统计结果。P p-mTOR 的统计结果。Q mTOR/p-mTOR 的统计结果。
通过敲低 lncRNA MIR210HG 抑制肿瘤的体内生长
在裸鼠体内成瘤性试验中，与 sh-NC 组和对照组相比，sh-MIR210HG 组的肿瘤重量和体积显著降低（图3 I, J）。同时，与 sh-NC 组相比，sh-MIR210HG 组的肿瘤生长速度较慢（P < 0.05）。蛋白质印迹分析表明，lncRNA MIR210HG 的抑制导致了肿瘤组织中自噬的抑制。结果显示 LC3B 表达减少而 P62 表达增加（图 3 K–M）。蛋白质印迹分析显示，在 Huh7-siRNA 处理组中，肿瘤组织中的 mTOR 蛋白表达在相同处理方案下没有显著变化（图 3 N, O）。相反，p-mTOR 的表达水平显著降低（图 3 P, Q）。
LncRNA MIR210HG 沉默降低了 Huh7 细胞的自噬
与 si-NC 细胞相比，LncRNA MIR210HG 沉默诱导的 LC3B 荧光囊泡数量显著减少（图4 A, B），而 P62 荧光囊泡数量增加（图 4 C, D）。蛋白质印迹分析表明，lncRNA MIR210HG 的抑制导致 Huh7 细胞自噬受到抑制。结果显示 LC3B 表达减少而 P62 表达增加（图 4 E–G）。结果表明，lncRNA MIR210HG 与 Huh7 细胞自噬小体形成以及自噬相关基因的调控之间存在密切相关性。
A LC3B 的免疫荧光结果。B LC3B 免疫荧光统计结果。C P62 免疫荧光统计结果。D P62 的免疫荧光结果。E 自噬相关蛋白 LC3B 和 P62 的 Western blot 检测结果。F LC3B 统计结果。G P62 统计结果。H mTOR 和 p-mTOR 信号通路蛋白的 Western blot 检测结果。I mTOR 统计结果。J p-mTOR 统计结果。K mTOR/p-mTOR 统计结果。
沉默 lncRNA MIR210HG 对 Huh7 细胞中 mTOR 信号通路的影响
哺乳动物靶标雷帕霉素代表一条普遍存在的信号通路，与细胞增殖密切相关。它调控细胞环境中一系列关键的生物过程，包括细胞代谢、增殖和凋亡。mTOR 的磷酸化形式，即 p-mTOR，体现了 mTOR 信号级联的激活状态；因此，它作为其激活的关键生物标志物。Western blot 分析显示，在相同处理范式下，Huh7-siRNA 处理组中的 mTOR 蛋白表达未表现出显著变化（图4 H, I）。相反，p-mTOR 的表达水平显著降低（图 4 J, K）。本研究结果表明，Huh7-siRNA 的机制性影响可能归因于其对 mTOR 磷酸化的调节，从而影响自噬通路。
总之，这项研究将 MIR210HG 鉴定为一种具有治疗潜力的新型自噬相关生物标志物，在肝细胞癌中可作为治疗靶点。这些发现为未来在诊断和个性化治疗这种恶性肿瘤方面提供了宝贵的见解。。
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