微精选

见图一

与 TNBC 代谢失调相关的选择性 RNA 剪接的特定景观。

图一

a 本研究中执行的分析过程的工作流程。

b 火山图说明了 2147 种蛋白质的蛋白质谱，在 TNBC 中显示异常蛋白质水平 （|log2-倍数变化|>1，Benjaminiu2012Hochberg 调整 P < 0.01）。一组涵盖各种功能类别的 372 种 RNA 相关蛋白被精心地进行颜色编码，以表示个体。

c TCGA 样品的 AS 景观 （n = 1096），由剪接事件 PSI 评分（左）和 109 个核心剪接体基因的表达水平（右）确定。每个点对应一个单独的样品，用颜色编码表示其样品类型，包括正常组织、非 TNBC 和 MPS。每个样品的位置被计算为高维剪接事件 PSI 矩阵和表达矩阵的 t-SNE 表示。

d 顶部：FUSCC-TNBC 队列中基底、非基底和正常组织之间剪接体基因表达的全局差异 （n = 360）。计算基底肿瘤和相应的正常组织（红色）、非基底肿瘤和相应的正常组织（绿色）以及正常组织的不同样本（海军蓝）之间的分布距离 （r.m.s.d.）。下图：FUSCC-TNBC 队列中 MPS 亚型之间剪接体基因表达的全局差异。计算 MPS1 （蓝色）、MPS2 （红色） 和 MPS3 （黄色） 肿瘤及其相应正常组织之间的分布距离 （r.m.s.d.）。P 值来自双侧 Wilcoxon 秩和检验和双侧 Kruskal-Wallis 检验 （***P < 0.001）。中心线表示中位数，框的边界表示第 25 个和第 75 个百分位数。

e 热图显示了 FUSCC-TNBC 队列中每个样本的肿瘤中上调的 42 个核心剪接体基因的标准化表达水平。对样本类型、 4 种 TNBC 转录组学亚型和 3 种 TNBC 代谢亚型进行了注释。

f MPS1 和 MPS2 之间 594 种注释代谢物的火山图。显著差异丰度的代谢物对于上调的 MPS1 呈蓝色，对于上调的 MPS2 呈红色。GPGH 、 GSR 、 GSS 、 LDHA、 LDHB 、 PFKM、 PFKP 和 UGP2 在 FUSCC-TNBC 队列中三种 MPS 亚型的 mRNA 表达 （Wilcoxon 试验）。 中心线表示中位数，框的边界表示第 25 个和第 75 个百分位数。IM 免疫调节亚型、LAR 管腔雄激素受体、BLIS 基础样免疫抑制亚型、MES 间充质样亚型、AMP 单磷酸腺苷、F-1,6-BP 果糖 1,6-二磷酸、NAD 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、SAM S-腺苷甲硫氨酸、3’，5′-ADP 腺苷 3’，5′-二磷酸。

见图二

SNRNP200 是糖酵解 TNBC 的关键调节因子，可在体外和体内促进肿瘤增殖。

a一个维恩图，描绘了 MPS2 枢纽基因与 42 个剪接体基因之间的重叠，这些基因的蛋白质水平在 TNBC 中上调。

b MDA-MB-231 细胞在补充有指定浓度葡萄糖的培养基中培养 16 小时。对细胞裂解物进行免疫印迹处理。

c MDA-MB-231 细胞缺糖 12 小时，然后用葡萄糖 （25 mM） 刺激指定时间。对细胞裂解物进行免疫印迹处理。

d 相关系数热图说明了肿瘤中上调的 U5 snRNP 基因的标准化 mRNA 表达水平与 FUSCC-TNBC 队列中代谢途径富集评分之间的关联（*P < 0.05;**P < 0.01）。

e 描述 U5 snRNP 核心组件的示意图。

f 对照和敲除 MDA-MB-231 细胞中 SNRNP200、EFTUD2 和 PRPF8 表达水平SNRNP200 Western blot 分析。用抗 SNRNP200 抗体对 g MDA-MB-231 细胞进行免疫沉淀，IgG 作为阴性对照。通过 western blot 分析分析 IP 数据 （左图）。对输入 RNase A 中的 U4、U5 和 U6 snRNA 水平进行 qPCR 分析−和 RNase A 组。使用 2 将相对 U4、U5 和 U6 snRNA 水平归一化为输入的水平+−Ct方法（右侧）。qPCR 分析数据表示为平均 ± SEM。

h 对照和SNRNP200敲除 MDA-MB-231 细胞中的 CCK-8 增殖测定。

i 显示 Snrnp200 靶向 ASO 治疗时间表的示意图大纲：将 4T1 小鼠乳腺癌细胞皮下注射到 BALB/c 小鼠中。当肿瘤达到 50-100 毫米3，小鼠用 ASO-Snrnp200 （5 mg/kg 皮下注射，每周 2 次） 或 PBS （50 μL，皮下注射，每周 2 次） 处理 2 周 （n = 5 只小鼠/组）。不同组的肿瘤生长。数据表示为平均 ± SEM。j 4T1 肿瘤的代表性图像说明了 ASO-Snrnp200 治疗的效果（n = 5 只小鼠/组）。

k 4T1 细胞来源的异种移植物肿瘤组织中小鼠 Snrnp200 蛋白表达的 k Western blot 分析。数据代表了三个独立的生物学重复。对于 g-i，如果每组中的数据呈正态分布，则使用 Student t 检验比较数据： ***P < 0.001;ns 不显著，P > 0.05。

见图三

葡萄糖水平升高会触发 PCAF 介导的SNRNP200乙酰化。

图三

a 如图所示，用 Myc 标记的 SNRNP200 和 HA-Ub 转染 HEK293T 细胞，并用 2.5 mM 或 25 mM 的葡萄糖处理。收获细胞用于泛素化分析。

b 免疫印迹分析SNRNP200、EFTUD2 和 PRPF8 蛋白水平，分析经或不经烟酰胺处理的 BT-549 细胞（NAM，5 mM，6 小时）、TSA（10 μM，16 小时）、Baf-A1（200 nM，16 小时）、NH4Cl （20 mM， 16 h） 或 Rapa （1 μM， 16 h）。MG132 处理 （10 μM，12 h） 用作阳性对照。

c、d 在有或没有 NAM、TSA 或 MG132 处理后，通过使用指定抗体的免疫印迹来测量HEK293T细胞中 SNRNP200 的泛素化水平 （c） 和乙酰化水平 （d）。

e 用抗 SNRNP200 抗体从 HEK293T 细胞中免疫沉淀内源性 PCAF，并通过 LC-MS 分析。数据显示了 PCAF 特征肽的 MS2 谱图。

f 将 Myc-SNRNP200 与 Flag 标记的 PCAF 共转染到 HEK293T 细胞中。通过免疫印迹法测定乙酰化。进行 Co-IP 测定以确定 SNRNP200 和 PCAF 之间的相互作用。

g Flag 标记的 PCAF 与 Myc 标记的 SNRNP200 和 HA 标记的泛素共转染。SNRNP200 的泛素化是通过用抗 HA 抗体进行 IP-western 印迹来确定的。

h 对照和耗尽 PCAF 的 BT-549 细胞中 PCAF 表达水平的蛋白质印迹分析。

i， j 维持在 25 mM 葡萄糖中的 BT-549 细胞用 siPCAF 或对照转染，并如前所述用 CHX 处理。通过免疫印迹 （i） 分析内源性 SNRNP200 、 EFTUD2 和 PRPF8 蛋白，并对肌动蛋白 （j） 进行定量。相对 SNRNP200 水平的数据表示为平均 ± SEM。

k BT-549 细胞用 siPCAF 或对照转染。通过免疫印迹分析 SNRNP200 的乙酰化水平。l BT-549 细胞用指定浓度的葡萄糖处理。通过免疫印迹分析 SNRNP200 的乙酰化水平。进行 Co-IP 测定以确定 PCAF 和 SNRNP200 之间的动态相互作用。m 在用指定浓度的葡萄糖处理的 BT-549 细胞中测量乙酰辅酶 A 水平。相对乙酰辅酶 A 水平表示为 SEM ±平均值。对于 j 和 m，使用 Student t 检验比较数据： ns 不显著，P > 0.05;P < 0.001。

见图四

SNRNP200 在赖氨酸 1610 位点的乙酰化可保护其免受蛋白酶体降解。

图四

a 从 HEK293T 细胞中免疫沉淀内源性 SNRNP200 并通过 LC-MS 分析。数据显示了在 K1610 位点乙酰化的特征肽的 MS2 谱图。

b 不同物种之间 SNRNP200 蛋白序列的比对。

c 通过 SWISS-MODEL 可视化 SNRNP200 的二级结构模型68.K1610 残基以不同的颜色突出显示。

d HEK293T 细胞用 Myc 标记的 SNRNP200 WT、K1610R 或 K1610Q 质粒转染 36 h，有或没有 TSA。针对免疫沉淀的 Myc 标签定量 SNRNP200 的乙酰化水平，并以 SEM ±平均值表示。

e 用指定的质粒转染 HEK293T 细胞，并用 2.5 mM 或 25 mM 的葡萄糖处理。通过免疫印迹揭示泛素化分析。

f HDAC1、HDAC2 和 HDAC5 在HEK293T细胞中过表达，无论是否处理 TSA。通过免疫印迹法测定 SNRNP200 的乙酰化水平。进行 Co-IP 测定以确定 SNRNP200 和 HDAC5 之间的相互作用。将 g HEK293T 细胞维持在补充有 2.5 mM 或 25 mM 葡萄糖的培养基中。通过 IP-western 印迹法测定SNRNP200泛素化水平。进行 Co-IP 分析以确定 SNRNP200 和 HDAC5 之间的动态相互作用。

h 用 siRNF123 或对照转染 BT-549 细胞。通过免疫印迹分析泛素化 SNRNP200 的水平。用 siRNF123 或对照转染维持在 2.5 mM 葡萄糖中的 i， j BT-549 细胞，并如前所述用 CHX 处理。通过免疫印迹 （i） 分析内源性 SNRNP200 、 EFTUD2 和 PRPF8 蛋白，并针对肌动蛋白 （j） 进行定量。相对 SNRNP200 水平的数据表示为 SEM ±平均值。

k 工作模型说明了糖酵解 TNBC 中 SNRNP200 的互斥乙酰化和泛素化。对于 d 和 j，使用 Student t 检验比较数据： ns 不显著，P > 0.05;*P < 0.05;**P < 0.01。

见图五

SNRNP200 增强了编码具有弱 5′ 剪接位点的代谢酶的基因中的 RNA 剪接。

图五

a 通过 Metascape 分析和可视化对照和 SNRNP200 敲低 MDA-MB-231 细胞中内含子保留转录本的富集网络。kappa 相似性高于 0.3 的代表性术语形成一个网络，并使用 Cytoscape 软件进行描述。

b 描述 GAPDH 的 RI（上图）和 GSS（下图）的鱼片图。指示 RI 读数的数量（蓝色为 control sgRNA，红色为 sgRNA SNRNP200 sgRNA）。

c MDA-MB-231 细胞中 SNRNP200 调节的 RI 事件的代表性 RT-PCR 验证。每种亚型的结构如图所示。显示单个数据点 （n = 3;*P < 0.05;*P < 0.01;**P < 0.001;学生 t 检验）。

d 对 RI 事件进行 5′ 剪接位点强度分析。使用同一组基因中的非保留内含子 （NRI） 进行比较 （Wilcoxon 秩和检验）。对同一组基因的 e 基序富集分析显示，最常鉴定的基序与 RI 和 NRI 的共有 5′ 剪接位点序列一致。f 通过将每个内含子的 GC 含量除以其相邻外显子的平均值来计算 RI 和 NRI 的 GC 组成，并通过 Wilcoxon 秩和检验进行比较。

见图六

SNRNP200 通过 RNA 剪接增强糖酵解和谷胱甘肽代谢。

图六

a 在对照和SNRNP200敲低 MDA-MB-231 细胞中分析的极性代谢物的火山图。显著差异丰度的代谢物按单个类别进行颜色编码。

b 对照细胞和 SNRNP200 敲低 MDA-MB-231 细胞脂质谱的火山图。具有显著差异的代谢物根据其各自的类别进行颜色编码。此外，评估了 SNRNP200 敲低 MDA-MB-231 细胞中 5 种不同脂质类别的比例。使用卡方检验 （***P < 0.001） 对数据进行统计分析。

c ALDOA、GAPDH 和 GSS 的 RI 图像。

d 对照和敲低 MDA-MB-231 和 BT-549 细胞中 SNRNP200、ALDOA、GAPDH 和 GSS 表达水平的 SNRNP200 、 ALDOA、GAPDH 和 GSS 的表达水平。

e 对照细胞和 SNRNP200 敲低 MDA-MB-231 细胞之间的 ECAR 比较。

f 总结了参与糖酵解、TCA 循环和谷氨酸代谢的代谢基因的图表。该图直观地描述了归一化代谢物水平（框）及其各自的上游代谢酶（圆圈），这些酶经历了SNRNP200消融诱导的内含子保留。UDP 尿苷 5′-二磷酸、G-1-P 葡萄糖 1-磷酸、G-6-P 葡萄糖 6-磷酸、Gal-1-P 半乳糖 1-磷酸、Ri-5-P 核酮糖 5-磷酸、R-5-P 核糖 5-磷酸、PEP 磷酸烯醇式丙酮酸、α-KG α-酮戊二酸、G-3-P 甘油 3-磷酸、1,3-BPG 甘油酸 1,3-二磷酸、NADP 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、FA 脂肪酸、GL 甘油脂、GP 甘油磷脂、SP 鞘脂、ST 甾醇脂质。

好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理.  数据分析等支持.也随时可以联系我们。