研究背景：
细菌遇到氨基酸全面缺乏时，会产生一个应急反应以停止大量基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），统称为(p)ppGpp。(p)ppGpp在严格应答中对毒力和发病机制的影响主要被认为是通过转录谱的变化，而不是通过这些分子与蛋白质靶点的直接结合。此外，(p)ppGpp合成酶存在于绿藻和植物叶绿体中，它们在非生物胁迫下积累，表明这些报警激素在细菌之外的作用尚未被探索。携带功能修饰的(p)ppGpp衍生物为研究不同(p)ppGpp相关生物学通路提供了重要工具。尽管新工具不断涌现以解析(p)ppGpp信号通路，但目前分子修饰位点仍局限于磷酸基基团和嘌呤环的8号位。由于(p)ppGpp独特的超磷酸化结构对其与生物靶标的相互作用具有显著影响，未来可能需要探索核苷上更多可修饰位点，以开发新型(p)ppGpp分子工具，尤其适用于捕获那些主要依赖多磷酸结构单元结合的蛋白质。
成果概述
本文中，作者开发了一种化学-酶法合成方法，该方法以7位修饰的脱氮嘌呤核苷三磷酸和ATP为底物，在Rel酶催化条件下合成一系列pppGpp衍生物，且产率可达到65%～89%。通过简单的金属偶联反应可获得体积较大基团修饰的GTP衍生物，这些GTP衍生物也是Rel蛋白的良好底物。此外，通过点击化学反应在炔基修饰魔斑核苷（pppGEpp）上偶联多功能把手可作为生物研究中钓取蛋白质的潜在分子工具。作者进一步探讨了炔基修饰对天然魔斑核苷互作蛋白和pppGEpp之间识别的影响。等温滴定曲线结果显示，pppGpp和pppGEpp与其结合蛋白之间亲和力均为微摩尔水平（KD值小于10µM），说明二者与蛋白之间具有相近结合能力。综上所述，这些易于获得的C7位取代pppGpp衍生物有望作为深入研究pppGpp及其结合蛋白的分子工具。
图文解析：
作者首先优化了以GTP和ATP为底物酶催化合成pppGpp的反应条件，包括ATP/GTP当量比、反应时间、温度及RelSeqNTD酶浓度等参数。在最优条件下，作者实现了毫克级pppGpp合成，充分验证了化学-酶法策略的高效性。
在选定条件下，作者研究了不同C7位取代GTP类似物在Rel蛋白催化反应中的活性（图1）。含小体积修饰基团的GTP类似物（GRTPs）可被RelSeqNTD高效识别，目标产物pppGRpps的产率达65%–89%，证明该酶对底物修饰具有较高兼容性。
图1.化学-酶法制备pppGpp衍生物的流程。a.C7–修饰核苷的合成;b.核苷的三磷酸化和C7-取代的pppGpp衍生物的合成。（来源：Chinese Journal of Chemistry）
作者通过Suzuki-Miyaura交叉偶联反应，引入体积较大的取代基（图2）。但产物pppGRpps的产率仅为3%–12%。大体积取代基可能削弱酶对底物的识别能力，导致催化效率显著下降。
图2.C7位取代GTP类似物（经交叉偶联反应制备）及其对应pppGpp衍生物。（来源：Chinese Journal of Chemistry）
高收率的炔基修饰pppGpp（pppGEpp）可作为多功能平台，通过点击化学反应生成多样化功能探针库。本研究将pppGEpp与氨基-PEG3-叠氮化物通过铜催化的1,3-偶极环加成反应进行偶联，成功以80%产率获得含三唑结构的点击产物（氨基-pppGEpp）。进一步利用市售试剂Sulfo-SBED（一种含生物素标签与pH敏感光反应性苯基叠氮基团的NHS酯），在弱碱性水溶液条件下与氨基-pppGEpp偶联（产率60%），最终合成三功能捕获探针（图3）。
图3.三功能pppGEpp捕获化合物的合成——含苯基叠氮交联剂与生物素标签。（来源：Chinese Journal of Chemistry）
在获得新型(p)ppGpp衍生物后，作者进一步探索其作为分子工具研究pppGpp结合蛋白相互作用的潜力。通过等温滴定量热法（ITC）测定了pppGpp及C7-炔基修饰的pppGpp与RelAEcNTD的结合亲和力（图4a和4b）。两者均处于微摩尔水平，表明C7-炔基修饰的pppGpp对RelAEcNTD的结合亲和力与天然pppGpp相近。此外，前人研究发现，pppGpp介导的SYNTH活性变构调节机制在单功能RelA与双功能Rel蛋白间具有保守性，基于此，作者进一步测试了pppGpp和pppGEpp分别与RelSeqNTD的结合能力（图4c和4d），KD值均处于同一数量级。作者推测RelSeqNTD中可能同样存在pppGpp结合的变构调控位点。
图4.基于等温滴定量热法（ITC）的pppGpp及pppGEpp与Rel酶（RelSeqNTD/RelAEcNTD）结合亲和力评估。（来源：Chinese Journal of Chemistry）
总结：本研究开发了一种高效的化学-酶法策略，通过一步焦磷酸化反应合成pppGpp衍生物。作者首次报道，C7位取代的脱氮嘌呤核苷三磷酸（含较小修饰基团或较大空间位阻）可作为底物被RelSeqNTD蛋白识别并催化生成pppGpp衍生物。通过等温滴定量热法（ITC）评估炔基修饰的pppGpp（pppGEpp）作为潜在生物分子工具与相互作用蛋白的亲和力，结果显示其与靶蛋白的结合亲和力达微摩尔水平（KD值低于10 µM）。上述结果表明，基于C7位取代的pppGpp衍生物易于功能化，是研究pppGpp与结合蛋白分子相互作用的适用工具。
本项目得到国家自然科学基金（U23A20106、22111530224、22304044、22473040）、河南省杰出青年创新研究群体（242300421005）和博士点基金（202103084）资助。
相关研究成果发表在Chinese Journal of Chemistry（DOI:10.1002/cjoc.70049），河南师范大学霍变变副教授为第一作者，河南师范大学朱安莲、李凌君教授为共同通讯作者。
课题组及作者简介：
经过多年的系统研究，李凌君教授团队形成了独特的研究思路，取得了一系列具有鲜明特色的研究成果：（1）创制了结构稳定、制备简便的cADPR模拟物和ADP-核糖化多肽，发展了三唑药效团改造核苷碱基的新策略。瑞士苏黎世大学Hottiger教授评述作者的方法是发展蛋白ADP-核糖化抗体的“firstmilestone”（https://www./2073-4409/10/3/680/htm）。（2）设计合成了复制活性最高的非天然碱基核苷酸，构筑了蛋白表达活性最佳的非天然碱基半合成生物体；并率先在国内组织建立了涵盖基础理论研究与关键技术的人工碱基基因密码研究平台。Perkel博士在JACS-spotlights上指出，李凌君教授开发的TPT3-NaM非天然碱基开创了人造基因密码研究的里程碑”（https://pubs./doi/10.1021/ja5003586）。目前，TPT3-NaM人工基因密码技术已实现产业化，并成功用于新一代高效、低毒抗黑色素瘤蛋白质药物的研发。（3）通过设计新型化学反应和催化剂，开发了系列生物大分子精准调控和标记技术，并已用于肿瘤免疫治疗等相关生物医学领域。
通讯作者简介：
李凌君，2007年毕业于北京大学医学部，获化学生物学博士学位，2012年在美国Scripps研究所完成博士后研究。现任河南师范大学化学生物学研究所所长，河南省特聘教授、中原科技领军人才、博士生导师。先后主持国家自然科学基金面上项目4项、中欧人才项目1项、青年项目1项、国家重点研发计划子课题1项、河南省杰出青年基金1项。研究成果被Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Cell、Chem. Biol.、Nucleic Acids Res.等国际著名期刊收录发表,并得到iNature、ScienceDaily、ACS和新浪医药等媒体积极评述和采访报道，被认为推动了相关生物医学领域的发展。获授权国际和中国发明专利10件，已转让5件。设计合成的分子也被多领域广泛使用，其中TPT3-NaM人工基因密码技术已实现产业化，并成功用于新一代高效、低毒抗黑色素瘤蛋白质药物的研发。
第一作者简介：
霍变变，女，副教授，硕士生导师。2020年毕业于东北大学，获分析化学博士学位，硕博连读期间主要在国家蛋白质科学中心（北京）进行科研合作，并于2019-2020年受国家留学基金委资助作为访问学者至加州大学河滨分校（美国）进行学术交流。于2020年11月入职河南师范大学，加入李凌君教授团队。基于博士期间的蛋白质组学研究背景，现主要协助探索非天然碱基在半合成生命体中毒理学相关研究，首次阐明了非天然碱基核苷酸代谢不稳定性的机制，并通过非天然碱基核苷酸的光不稳定性发现其具有作为生物交联剂的能力。以第一作者身份发表SCI论文7篇。主持有国家自然科学基金青年项目1项。