2.1. 配对平滑肌瘤和子宫肌层中 sncRNA 表达的高通量测序
使用高通量下一代 RNA 测序（NGS），作者之前在 Lyo 和配对 Myo 中鉴定了 MED12 突变和种族/种族相关 lncRNA 的差异表达谱以及编码转录本[7,8,9]。 在这项研究中，作者对从 19 对 Lyo 和 Myo 标本中提取的 RNA 进行了 NGS，按种族/民族分层（白色：n = 7;黑色：n = 12）和 MED12 突变状态（突变：n = 10;非突变：n = 9）。经过归一化、分层聚类和 TreeView 分析，作者鉴定出 2189 个 sncRNA（14 个 snRNA、91 个 snoRNA、875 个 miRNA、478 个 piRNA、30 个 RNA 假基因和 701 个未分类）与配对 Myo 相比，在 Lyo 中的表达发生了改变（≥1.5 倍变化，向上或向下; 图 1 火山图分析（倍数变化≥1.5，p < 0.05; 图 1B）和主成分分析（PCA）显示了 Lyo 和 Myo 之间不同的 RNA 转录模式，k-means 聚类证实了数据的可靠性（ 图 1C）。基因本体 （GO） 和 KEGG 通路富集分析表明，这些改变的 sncRNA 主要参与癌症中的蛋白聚糖和 MAPK 信号传导等途径（ 图 1D）。
sncRNA 在平滑肌瘤 （Lyo） 与子宫肌层 （Myo） 中的差异表达。（A）分层聚类热图显示 19 对 Lyo 和匹配子宫肌层样本中差异表达的 sncRNA（倍数变化≥1.5，p < 0.05）。 颜色渐变将基因表达水平表示为 z 分数。（B）火山图显示显着上调（粉红色;n = 447）和下调（绿色;n = 317）sncRNA，错误发现率 （FDR） p 值 < 0.05。（C）配对 Lyo 和 myo 样品的 RNA-seq 数据的主成分分析（PCA）图（n = 19）。每个点对应一个样本，子宫肌层样本 （Myo） 为黑色，平滑肌瘤样本 （Lyo） 为红色。（D）基因本体（GO） 和 KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析，突出显示与 Lyo 中差异表达 sncRNA 相关的通路。
接下来，作者检查了 MED12 突变状态对 sncRNA 表达的影响。倍数变化分析（Lyo/Myo）显示，在 MED12 突变组中，有 343 个（1 个 snRNA，18 个 snoRNA，215 个 miRNA，78 个 piRNA，3 个 RNA 假基因和 28 个未分类）sncRNA，表达改变（≥1.5 倍变化，向上或向下）。分层聚类和 TreeView 分析将这些转录本分类为不同的组（ 图 2A）。17 个 sncRNA 在 MED12 突变组中显示出独特的差异表达，在非突变组中变化最小，如热图所示（ 图 2B）。对这 17 个 sncRNA 的 GO 和 KEGG 分析强调了它们在生长因子受体和 PI3K-Akt 信号通路信号转导中的作用（ 图 2C）。基于种族/民族的比较确定了 293 个（11 个 snoRNA、160 个 miRNA、89 个 piRNA、5 个 RNA 假基因和 28 个未分类）sncRNA，与白人女性相比，黑人女性的表达改变（≥1.5 倍变化，上升或下降）。分层聚类和 TreeView 分析将这些 sncRNA 分类为不同的组（ 图 3A）。31 个 sncRNA 在黑人女性中独特差异表达，在白人女性中没有显着变化（ 图 3B）。GO 和 KEGG 通路分析显示，这些 sncRNA 富集在与 DNA 结合、转录激活因子活性和白细胞介素信号传导相关的通路中（ 图 3C）。
sncRNA 在按 MED12 突变状态分层的配对样品中的差异表达。（A）分层聚类热图显示 MED12 突变（n = 10）和非突变（n = 9）组之间差异表达 sncRNA 的倍数变化（Lyo/paired Myo）（倍数变化≥1.5，p < 0.05）。 颜色渐变将基因表达水平表示为 z 分数。（B）描述了在 MED12 突变组（n = 10）中唯一鉴定的 17 个富集基因（Lyo/配对 Myo）的热图，但在非突变组（n = 9）中没有（倍数变化≥1.5，p < 0.05 ）。颜色渐变以 z 分数的形式反映基因表达水平。（C）基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，说明与 17 种差异表达 sncRNA 相关的通路。
sncRNA 在按种族组分层的配对样本中的差异表达。（A）分层聚类热图显示黑人（n = 12）和白人（n = 7）组之间差异表达 sncRNA 的倍数变化（Lyo/ 配对 Myo）（倍数变化≥1.5，p < 0.05 ）。颜色渐变将基因表达水平表示为 z 分数。（B）描述 31 个富集转录本（Lyo/配对 Myo）的热图，在黑人组 （n = 12） 中唯一识别，但在白人组 （n = 7） 中没有（倍数变化 ≥ 1.5，p < 0.05）。 颜色渐变以 z 分数的形式反映基因表达水平。（C）基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，说明与 31 种差异表达 sncRNA 相关的通路。
2.2. qRT-PCR 验证 sncRNA 表达
为了验证 RNA 测序结果，选择了 10 个先前在其他疾病模型中研究过的 sncRNA，用于未接受激素药物治疗的绝经前患者的 51 对 Lyo 和 Myo 组织进行验证。由于本研究中鉴定的大多数差异表达 sncRNA 是 miRNA 和 piRNA，因此作者没有选择任何 snRNA 或 snoRNA 进行验证。基于比较 Lyo 和 Myo 组织的 RNA 测序分析（≥1.5 倍变化，向上或向下），miR-19a-3p、miR-99a-5p、piR-009295、piR-020326 和 piR-020365 下调，而 piR-006426 和 piR-020485 上调。选择这些 sncRNA 进行 qRT-PCR 验证，这证实了与配对 Myo 相比，Lyo 中所有选定的 miRNA 和 piRNA 显着下调 （p < 0.05;图 4）。然而，在 qRT-PCR 中观察到的 piR-006426 和 piR-020485 的表达模式与 RNA 测序结果并不完全一致。在 MED12 突变状态的背景下，RNA 测序发现 miR-19a-3p、miR-99a-5p、miR-3196、miR-499a-5p、miR-30d-3p、piR-020485（均下调）和 piR-006426（上调）在比较突变体 （Lyo/Myo） 与野生型 （Lyo/Myo） 组织（≥1.5 倍变化）时发生显着改变。qRT-PCR 验证显示，miR-99a-5p、miR-3196、miR-30d-3p、piR-006426 和 piR-020485 在 MED12 突变体组中显著下调（图 5）。按种族/民族分层的进一步分析显示，miR-499a-5p 和 miR-30d-3p 在 Lyo 组织中存在显着差异表达，与黑人女性相比，西班牙裔女性的表达水平更高（图 6）。然而，qRT-PCR 表达模式与 RNA 测序结果并不完全匹配。 具体来说，RNA 测序在比较黑人组和白人组时发现 miR-30d-3p 和 piR-020485（上调）、piR-009295、piR-020326、piR-020365 和 piR-006426（均下调）的显着改变（Lyo/Myo，≥1.5 倍变化）。
通过 qRT-PCR 评估的 51 个 Lyo 和配对 Myo 样品中选定 sncRNA 的表达水平。结果显示为 SEM±平均值，显着性水平用星号表示（**p < 0.01;*** p < 0.001）。
通过 qRT-PCR 测量的 MED12 突变（n = 33）和非突变（n = 18）标本中 sncRNA（Lyo/配对 Myo）的表达倍数变化。结果以 SEM±平均值表示，显着性水平用星号表示（*p < 0.05;** p < 0.01）。
通过 qRT-PCR 测量白人（n = 6），黑人（n = 12）和西班牙裔（n = 29）组中 sncRNA（Lyo/paired Myo）的倍数变化表达。结果以 SEM±平均值表示，显着性水平用星号表示（*p < 0.05;** p < 0.01）。
总结
总之，作者的研究结果提供了 Lyo 中差异表达 sncRNA 的全面概况，并指出种族/民族和 MED12 突变状态作为进一步影响其表达的变量的显着影响。sncRNA 的异常表达可能通过与其他非编码 RNA（例如 lncRNA）和蛋白质编码基因的动态调控相互作用，可能影响关键的细胞过程，如细胞增殖、ECM 积累和炎症，从而促进 Lyo 的发育和进展。未来的研究需要进一步阐明 sncRNA 在 Lyo 病理生物学中的作用的表达模式、调控网络和分子机制。
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