FH 缺陷型 RCC 是一种由富马酸水合酶基因失活驱动的侵袭性癌症综合征。为了研究与 FH 缺陷型 RCC 相关的潜在表型，作者在之前的调查中使用了 Renji 队列的数据（14），其中包含来自三名 FH 缺陷型 RCC 患者的原发性癌症和邻近正常组织的批量 RNA-seq 数据（ 图 2A）。之后，作者比较了癌症与邻近正常组织之间不同基因的表达水平（ 图 2B），一些糖酵解相关基因，如 ENO1、PLOD2 和 PKM 被上调。考虑到 FH 中的功能丧失突变会引发以三羧酸 （TCA） 循环通量缺陷为特征的代谢危机，迫使细胞代谢重编程向有氧糖酵解，作者推测糖酵解在 FH 缺陷的 RCC 癌组织中可能更活跃。因此，作者对糖酵解途径进行了 GSEA 分析，可以预见的是，FH 缺陷型 RCC 的癌组织中糖酵解途径存在显着的正富集（ 图 2C）。接下来，作者研究了 FH 缺陷型 RCC 的糖酵解与 ICI 结果之间的关系。图 2D显示了先前发布的数据集中 FH 缺陷 RCC 的 t 分布式随机邻域嵌入 （t-SNE） 可视化。与部分缓解 （PR） 患者相比，疾病进展 （PD） 患者的糖酵解水平显着更高（ 图 2E）。特别是，与其他细胞类型相比，糖酵解在癌细胞（ 图 2F 中的上皮细胞）中更富集。 由于糖酵解是一种关键的代谢途径，在许多癌症中经常上调 （87），作者在另一种肾癌类型透明细胞肾细胞癌（ccRCC） 中检查了上述结果，并观察到了类似的发现，如图 2G-I所示，进一步支持糖酵解在影响 ICI 治疗结果方面的潜在作用。
在 FH 缺陷型 RCC 和 ccRCC 中，糖酵解活性与对 ICI 的反应呈负相关。（A）FH 缺陷 RCC 标本中批量 RNA-seq 分析的工作流程示意图。（B） 通过火山图将 FH 缺陷的 RCC 肿瘤与匹配的正常组织进行比较可视化的差异表达谱。划定了显着上调的基因（红色）、下调的基因（蓝色）和非显着转录本（灰色）。（C） 通过基因集富集分析（GSEA）在 FH 缺陷的 RCC 标本中显示出糖酵解途径基因的显着富集。（D） 使用 t-SNE 可视化对 FH 缺陷的 RCC 细胞群进行降维分析。（E） 通过雨云图量化的糖酵解活性的比较分布，按治疗反应类别（PR，部分反应;PD，进行性疾病）在 FH 缺陷型 RCC 病例中。（F）FH 缺陷型 RCC 肿瘤微环境中的细胞类型特异性糖酵解代谢评分。（G）UMAP 投影说明了透明细胞肾细胞癌（ccRCC）标本中的细胞异质性。（H）ccRCC 生态系统中基于细胞区室的糖酵解定量。（I） 治疗反应相关的糖酵解谱（CR，完全反应;MR，混合反应;R，抗性）通过雨云图描绘了 ccRCC 队列。（*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001）。
为了进一步研究糖酵解在 ICI 反应中的作用，在 BCC 和 SKCM 癌症数据集中探讨了 ICI 结果与糖酵解强度之间的关系。在 BCC 中，图 3A，B 表明，与反应者（R）相比，无反应者（NR）表现出更高的糖酵解强度。图 3C 所示的定量分析进一步证实了这一发现，表明 NR 亚组的糖酵解强度明显高于 R 亚组。对于 SKCM，使用了一个额外的数据集（18），该数据集排除了缺乏恶性细胞数据的样本，以验证研究结果。然而，由于一些反应者的数据缺失，因此对初治（TN） 患者和 NR 进行了比较。据推测，初治患者可能包括潜在的反应者和无反应者。分析还表明，SKCM 队列中 NR 亚组的糖酵解强度明显高于 TN 亚组，如图 3D-F所示（p < 0.001）。
糖酵解强度与其他癌症类型的 ICI 结果呈负相关。（A、D） 按治疗反应状态分类的 BCC 和 SKCM 恶性细胞的 t-SNE 图谱。（B，E）BCC 和 SKCM 恶性细胞的 t-SNE 可视化，深蓝色和深红色分别表示糖酵解评分低和高。（丙、女）BCC 和 SKCM 标本中无反应者 （NR） 和反应者 （R） 或初治 （TN） 患者之间糖酵解评分的比较雨云分布分析。（*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001）。
基于泛癌 scRNA-seq 数据集的 Glyc.Sig 开发
由于糖酵解的强度与 ICI 耐药性显着相关，作者建议包含反映糖酵解水平的基因集，称为糖酵解特征（Glyc.Sig），可能有助于预测 ICI 反应。因此，作者利用 41 个泛癌 scRNA-seq 数据集来开发 Glyc.Sig.肿瘤糖酵解富集评分与基因表达水平之间最初采用 Spearman 相关性。Gx 基因集包含与糖酵解强度评分呈正相关的基因（R > 0 和 FDR < 1e−05）。Gy 基因集在恶性细胞中包含显著过表达的基因。作者将 Gx 和 Gy 相交，在每个数据集中（n = 1,2,…,41）中制定 Gn 基因集（18），其中包含与糖酵解强度呈正相关的肿瘤特异性上调基因。对于 G1–G41 基因集中的每个基因，作者计算了 Spearman R 值的几何平均值，并选择最终 R 平均值大于 0.3 （88）的基因来形成 Glyc.Sig。详细的基因列表。Glyc.Sig 生成的简化过程可以在图 4A 中直观地观察到。此外，采用基于 Reactome（图 4B）和 KEGG（图 4C）的通路分析来探索 Glyc.Sig 的生物学功能。过多的途径主要与糖酵解、缺氧、KEAP1-NFE2L2 途径、G1/S DNA 损伤检查点、谷胱甘肽代谢和碳水化合物代谢过程有关。
Glyc.Sig 的结构和功能描述。（A） circos 图说明了 Glyc.Sig 构建的开发工作流程。（乙、丙） 对 Glyc.Sig 中的基因进行功能通路富集分析。（B） 基于 Reactome 数据库的前 20 条富集途径;（C） 前 20 个显著富集的 KEGG 通路。（D） Circos 可视化揭示了 Glyc.Sig 与各种恶性肿瘤中免疫相关基因表达之间的相关性。垂直勾号标记线表示不同的癌症类型，对应于 （E） 中的 x 轴。（E） 热图可视化，说明了多种癌症类型中 Glyc.Sig 与免疫细胞浸润水平之间的关系。
作者首先研究了 Glyc.Sig 与 75 个免疫相关基因 （58）之间的关系，包括 HLA 集、刺激集和抑制集。在 30 种不同癌症类型的几乎所有 75 个基因中都发现了普遍的负相关（图 4D）。图 4E 展示了免疫细胞浸润的情况。较高水平的糖酵解强度与各种类别的免疫细胞浸润呈负相关，包括细胞毒性细胞（CD8 T 细胞、细胞毒性淋巴细胞、NK 细胞）、B 谱系细胞和髓系树突状细胞。上述分析表明，糖酵解强度高的肿瘤的抗肿瘤免疫力下降。
接下来，作者探讨了 HALLMARK 通路的富集与 Glyc.Sig 表达强度之间的联系。两者都是通过 GSVA 计算的。所有前 10 个 HALLMARK 通路，包括 DNA 修复、MYC 信号传导和糖酵解，都与 Glyc.Sig 的表达强度呈正相关（图 5A）。根据之前的研究，所有这些途径都可能与较弱的免疫反应有关（89–91）。作者还探讨了三级淋巴结构（TLS）相关基因富集与 Glyc.Sig 表达强度之间的关系。如图 5B 所示，TLS 评分以及大多数 TLS 相关基因与 Glyc.Sig 的表达强度呈负相关。值得注意的是，高 TLS 评分和相关基因通常表明免疫细胞浸润丰富。此外，作者研究了 Glyc.Sig 的中位数分数与中位数 ITH 以及中位数 TMB 之间的关系。ITH 是促进免疫抑制的特征 （92）。正如预期的那样，Glyc.Sig 的表达强度与 ITH 呈正相关（R = 0.64，p = 0.00014， 图 5C）。 然而，发现 TMB 和 Glyc.Sig 之间存在正相关联系（R = 0.8，p = 9.1e−8， 图 5D），这似乎与作者目前对 TMB 的理解背道而驰。一般来说，由于丰富的抗原性，较高的 TMB 意味着更好的免疫反应，而高水平的 Glyc.Sig 则相反。 以 Glyc.Sig 的 GSVA 评分中位数和 TMB 中位数为分组标准，将患者分为 4 个不同的亚组：高 Glyc.Sig/高 TMB（HGHT）、高 Glyc.Sig/低 TMB（HGLT）、低 Glyc.Sig/高 TMB（LGHT）和低 Glyc.Sig/低 TMB（LGLT）。首先，作者阐明了高 Glyc.Sig 和低 TMB 都减少了细胞毒性淋巴细胞浸润（图 5E），这与作者目前的理解一致。作者进一步比较了 LGLT、LGHT、HGLT 和 HGHT 亚组之间的免疫细胞浸润。LGHT 被确定为细胞毒性淋巴细胞和 NK 细胞浸润最高的组，而 HGLT 被发现在大多数免疫细胞中浸润最低，包括细胞毒性淋巴细胞、单核细胞谱系、CD8 T 细胞、NK 细胞、T 细胞和 B 谱系（图 5F).至于 LGLT 和 HGHT 亚组，情况似乎尚不清楚，可能是因为这两个亚组同时具有免疫刺激因子和抑制因子。
研究 Glyc.Sig 与免疫耐药之间的潜在关系。（A） 说明 Glyc.Sig 与前 10 个 HALLMARK 信号通路之间关系的热图。（B） 描述 Glyc.Sig 和 TLS 相关基因之间关系的热图。（C） 散点图显示了泛癌数据集中 Glyc.Sig 的中位 GSVA 评分与中位瘤内异质性 （ITH） 之间的关联。（D） 泛癌数据集中 Glyc.Sig 的 GSVA 评分中位数与中位 log10 肿瘤突变负荷（TMB）水平的相关性分析。（E） 比较箱线图，分析 MCP 水平与 Glyc.Sig 活性之间的关系。（F） 评估不同 Glyc.Sig 状态和 TMB 组中特定免疫细胞浸润模式的箱线图（Mann-Whitney U 检验;ns，不显著;*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
为探究 Glyc.Sig 的预后价值，整理分析了 10 个 ICI 队列的批量 RNA-seq 数据和相应的临床数据，构建了基于 Glyc.Sig 的 ICI 反应预测模型。为了更好地利用这些数据，作者将它们分为三个子集：基于重复 10 次的五重交叉验证的模型训练和参数调整的训练集（癌症类除外）;根据 AUC 进行模型比较和选择的验证集;以及用于最终模型诊断的独立测试集。流程图反映了整个过程（图 6A）。一开始就合并和训练了七种不同的模型;最终选择朴素贝叶斯作为 Glyc.Sig 模型，AUC 最高，为 0.69（图 6B）。接下来，作者利用独立的测试集通过预测 ICI 响应来进一步评估 Glyc.Sig 模型。最终观察到 0.66 的 AUC（图 6C）。
基于 Glyc.Sig 的 ICI 结果预测模型的构建和验证。（A） 开发 Glyc.Sig 模型的工作流程包括训练、验证和测试阶段，如流程图所示。训练阶段结合了五重交叉验证，以优化多种机器学习方法之间的参数。在验证过程中，选择表现出最佳 AUC 性能的朴素贝叶斯（nb）算法作为最终的 Glyc.Sig 模型（参数：fL = 0，adjust = 1，usekernel = TRUE）。（B） 验证队列中各种机器学习算法的预测准确性评估，通过 AUC 值进行量化。（C） 受试者工作特征（ROC）曲线，说明最终 Glyc.Sig 模型（nb 算法）在验证和独立测试队列中的分类性能。（D） 模型预测的高风险（无反应者）和低风险（反应者）亚组之间的比较生存结果，通过验证和测试数据集中的 Kaplan-Meier 生存曲线可视化。（E） 不同队列中泛癌特征疗效的 circos 图可视化，纵轴代表 AUC 测量值。（F） 显示 Glyc.Sig 和已建立的泛癌特征之间的预测性能（AUC 值）的比较热图。（G） 将 Glyc.Sig 的 AUC 值与其他泛癌特征进行比较的条形图可视化。TPR，真阳性率;FPR，假阳性率;AUC，曲线下面积;HR，风险比;CI，置信区间。
为了评估 Glyc.Sig 对总生存期（OS）的预测价值，根据 Glyc.Sig 模型给出的 ICI 反应预测，将患者分为高危组（预测无反应者，NR）和低风险组（预测反应者，R）。Kaplan-Meier 生存分析表明，在验证和测试队列中，高风险组的 OS 明显短于低风险组（p < 0.01， 图 6D）。在验证队列中，低风险组的中位 OS 为 29.9 个月（HR = 1.83,95%CI 1.17–2.86），几乎是高风险组观察到的 OS（14.42 个月）的两倍。在试验队列中，低危患者的中位 OS 为 31.7 个月，而高危受试者的 OS 为 11.23 个月（HR = 2.28,95%CI：1.27–4.09）。随后，作者检查了 Glyc.Sig 预测模型在 10 个 ICI RNA-seq 队列中的每一个队列中的表现。这 10 个队列的 AUC 范围为 0.53 至 0.91，其中 Riaz 在 2017 年 SKCM 队列的 AUC 达到最高（AUC = 0.91,95% CI：0.82–0.99），其次是 Mariathasan 在 2018 年的 UC 队列（AUC = 0.90,95% CI：0.87–0.94）。赵 2019 年的 GBM 队列表现出最低的预测准确性（AUC = 0.53,95% CI：0.24–0.82），这可能归因于其样本量有限。至于生存分析，由于缺乏 OS 数据，Kim 在 2018 年的 GC 队列被排除在外。对于其余 9 个队列，Glyc.Sig 模型预测的高危患者显示出显着的生存获益。 在 2015 年的 SKCM 队列 （Van Allen）、2017 年的 UC 队列 （Synder）、2018 年的 UC 队列 （Mariathasan）、2019 年的 SKCM 队列 （Liu） 和 2019 年的 SKCM 队列 （Gide） 中进行了值得注意的观察。
通过计算每个基因特征的 AUC 来比较 Glyc.Sig 和其他构建良好的预测基因特征。与其他基因特征 （81–85）相比，Glyc.Sig 在验证队列中表现最佳（图 6E），AUC 为 0.69。此外，Glyc.Sig 在 10 个单独的 ICI 队列中的大多数中表现出最佳性能，而大多数其他特征仅在一两个队列中表现理想（图 6F）。作者还比较了 10 个单独的 ICI 队列中这些基因特征的平均 AUC。值得注意的是，Glyc.Sig 以 0.76 的平均 AUC 占据主导地位，以 0.62 的 AUC 超过了第二个签名 （INFG.sig）（图 6G）。
从 7 个 CRISPR 队列中收集了与基因敲除相对应的免疫应答数据。根据所采用的模型细胞和治疗，这些队列进一步分为 17 个数据集。这些数据集中总共记录了 22,505 个基因。通过根据基因的平均Z 分数对基因进行排名，作者确定排名靠前的基因具有免疫抵抗性，这表明它们的敲除可以增强抗肿瘤免疫。相反，排名垫底的基因被归类为免疫敏感基因，表明它们的敲除可能会抑制抗肿瘤免疫。排名过程如图 7A所示。在 22,505 个基因中，排名前 5%、10%和 20%的基因数量分别为 1,125、2,250 和 4,501 个。为了进一步研究 Glyc.Sig 的免疫治疗价值，作者随后计算并比较了 Glyc.sig 中排名前 5%、10%和 20%的基因的比例，以及之前报道的其他免疫耐药基因特征，包括 TcellExc.Sig、ImmuneCells.Sig、IMS。西格，LRRC15。咖啡馆。Sig 和 CRMA。西格 （18， 83， 93–95）。IPRES 特征因其独特的途径而不是基因组成而被排除在外。正如预期的那样，与其他基因特征相比，Glyc.Sig 具有最高比例的交集顶级基因（图 7B）。免疫抵抗基因（前 20%）在 Glyc.Sig 中显著富集（p = 0.02，Fisher 精确检验）。 Glyc.Sig 中 PSMF1、GCLC、CES1、MAF1、LDHA、KLHL24、FCGR2B、POLR2K、MCCC1、GPI、COMMD8、C19orf24、DNAJC12、YDJC、HSPB7、DERL1、NDUFA4L2、AGTRAP、RNF128、MRPL10、EIF5A2、B3GNT3、SSR1、DNAJC2、SDCCAG8、TPI1、CKAP4 等 27 个基因位列前 20%。使用一系列独立的 CRISPR 数据集（图 7C）验证了肿瘤免疫调节与这些糖酵解相关基因之间的关系，表明它们作为与免疫检查点阻断（ICB）联合治疗靶点的潜力。
使用 CRISPR 筛查数据将 LDHA 确定为 FH 缺陷型 RCC 的潜在治疗靶点。（A） 基于 CRISPR 亚组对抗肿瘤免疫反应的敲除效应的基因优先级。该分类是通过汇总 Z 分数计算确定的，等级越高意味着对免疫抵抗的贡献越大。热图中的空缺反映了主要实验队列中缺乏基因水平数据。（B） 雷达图显示了与其他预测特征相比，CRISPR 数据集中 5%、10%和 20%排名靠前的基因中 Glyc.Sig 相关基因的相对表示频率。（C）Z-score 可视化矩阵，描绘了从 CRISPR 数据集中排名前 20%的排名靠前 20%的 Glyc.Sig 基因。（D） 由 LDHA 表达水平标记的 FH 缺陷 RCC 样品的均匀流形近似和投影（UMAP）图。（E）FH 缺陷型 RCC 转移病灶、原发病灶及邻近正常组织中 LDHA 表达水平的比较。（F）FH 缺陷型 RCC 及邻近正常组织中 LDHA 表达的免疫印迹分析。（G） 肿瘤和邻近正常组织区域中 LDHA 的代表性 IHC 染色图像。
鉴于糖酵解的上调以及 Glyc.Sig 在 FH 缺陷型 RCC 和泛癌数据中的预测价值，作者假设 CRISPR 队列的枢纽基因 LDHA 可能在此过程中发挥关键作用。LDHA 编码糖酵解的最后一步，其中丙酮酸转化为乳酸，产生 ATP。对 FH 缺陷的 RCC scRNA-seq 数据集的分析表明，与其他细胞类型相比，FH 缺陷的 RCC 上皮细胞（图 7D）中的 LDHA 表达明显更高。此外，当使用 GSE157256 数据集（15）比较转移、原发肿瘤和邻近正常组织的 LDHA 表达时，作者发现邻近正常组织中的 LDHA 水平显着降低（图 7E）。为了进一步证实这些结果，仁济医院患者的免疫印迹分析和 IHC 染色显示，与正常邻近组织相比，肿瘤组织中的 LDHA 表达显着更高（图 7F 、G）。
总结
作者的研究标志着第一个将癌症葡萄糖代谢与免疫检查点抑制剂耐药性联系起来的有力临床证据。通过分析各种癌症的单细胞转录组学，作者设计了 Glyc.Sig，这是一种基因表达特征，在预测不同患者群体的 ICI 治疗反应方面优于既定特征。这一特征不仅增强了作者识别可能从免疫疗法中受益的患者的能力，而且还发现了新的治疗途径，特别是强调了 LDHA 作为 FH 缺陷型 RCC 治疗的联合治疗靶点。作者的研究结果为精准免疫治疗开辟了途径，并提出了通过靶向癌症糖代谢来增强对肿瘤的免疫反应来克服 ICI 耐药性的策略。
|