单细胞 RNA 转录组揭示了原发性和转移性 OS 之间的异质性
收集了包含七个原发性 OS 样本和两个转移性 OS 样本的 scRNA-seq 数据集，以阐明细胞组成 （Fig. S1A ）。经过质量控制过滤后，保留了来自原发患者的 67,265 个细胞和来自转移患者的 18,226 个细胞的基因表达谱以供进一步分析。降维后基于无监督图的细胞聚类识别了几个簇，这些簇可以分配给 OB 细胞，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），成软骨细胞（CB），成纤维细胞，内皮细胞，髓系细胞，破骨细胞（OC），周细胞，成肌细胞和一个名为其他的簇（ Fig. 1 A，B）。t-SNE 可视化显示综合数据中细胞的混合分布良好 （ Fig. S1B ）。转移性样本富含 OB 细胞和 TIL，而髓系细胞和 OC 细胞含量低于原代样本（ Fig. 1 C），表明病灶间存在瘤间异质性。
单细胞 RNA 转录组揭示了原发性和转移性 OS 之间的异质性。（A） 主要细胞谱系的 t-SNE 可视化。（B） 点图显示了 10 个细胞簇中 22 个特征基因的平均表达量。点大小表示每个簇中表达基因的细胞比例，色谱表示特征基因的平均表达水平。（C） 如图所示，原发性和转移性组织中 10 个簇的相对比例。（D-F） OB 细胞亚群 （D）、CB 细胞亚群 （E） 和 OC 细胞亚群 （F） 的 t-SNE 可视化。（G-I） 点图显示了 OB 细胞亚群（G），CB 细胞亚群（H）和 OC 细胞亚群（I）中选定特征基因的平均表达。点大小表示每个子集中表达基因的细胞比例，色谱表示标记物的平均表达水平。（J，K） 骨髓细胞亚群（J）和 TIL 亚群（K）的 t-SNE 可视化。（左、小） 点图显示骨髓细胞亚群 （L） 和 TIL 亚群 （M） 中选定特征基因的平均表达。点大小表示每个子集中表达基因的细胞比例，色谱表示标记物的平均表达水平。
scRNA-seq 样本的组织学亚型为 OB 和 CB，使用 Seurat 提取 5 个簇，进一步定义细胞亚群，包括 OB 细胞、TIL、髓系细胞、OC 细胞和 CB 细胞。OB 谱系亚群的TNC、S100A11、GTSE1 和 CTSD 表达量相对较高（ Fig. 1 D，G），而 CB 谱系亚群的表达量为 CREB3L1、FGFBP2 和 ATAD3A（ Fig. 1 E，H）的表达量相对较高。将 OC 细胞分为 5 个 THOP1、IBSP、RPS28、NENF 和 DNM1 表达较高的亚群（ Fig. 1 F，I）。骨髓细胞聚集为中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞、IFIT1+ 巨噬细胞和 IFIT1- 巨噬细胞（ Fig. 1 J，L）。TIL 分为 7 个亚群，调节性 T 细胞（Treg）细胞、增殖 T 细胞、自然杀伤（NK）细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ T 细胞、CD4−/CD8−T 细胞和 B 细胞（ Fig. 1 K、M; Fig. S1C ）。
GTSE1+ OB 细胞和 CREB3L1+ CB 细胞富集于转移性肿瘤中
估计每个样本中每个子集的比例，并在组织中进行缩放（Fig. 2 A）。简而言之，确定了两种不同的细胞丰度模式（原发性 OS 高和转移性 OS 高）。转移样本富集 S100A11+ OB 细胞、GSTE1+ OB 细胞、CTSD+ OB 细胞、CD4−/CD8− T 细胞、CREB3L1+ CB 细胞、CD4+ T 细胞、Treg 细胞和成肌细胞，IFIT1− 巨噬细胞、THOP1+ OC 细胞、树突状细胞、单核细胞、CD8+ T 细胞、DNM1+ OC 细胞等 .，与主要样品（ Fig. 2 A）相比。
GTSE1+ OB 细胞和 CREB3L1+ CB 细胞富集于转移性肿瘤中。（A） 热图显示了原代组织和转移组织之间的细胞亚群比例，颜色代表缩放后的细胞比例。（B-D）（B）、（C） GSE21257 和 TARGET（D）中原 GSE33382 发性和转移性样本中细胞特异性差异表达基因的 ssGSEA 评分差异显著。（E-G） 临床信息的热图，包括类型、年龄、性别、组织学亚型和 （E）、 GSE21257 （F） 和 TARGET （G） 中的 GSE33382 Huvos 等级。p 值通过双尾 Wilcoxon 秩和检验计算。∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001。
与 scRNA-seq 数据的结果一致，转移样本的GTSE1+ OB 细胞和 CREB3L1+ CB 细胞评分显著增加，而原代样本 CD8+ T 细胞、IFIT1− 巨噬细胞、RPS28+ OC 细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、IFIT1+ 巨噬细胞和 DNM1+ OC 细胞评分增加（p< 0.05，双尾 Wilcoxon 秩和检验; Fig. 2 A-D）。尽管批量数据集中的转移样本的特征是 NK 细胞得分相对较低（p < 0.05，双尾 Wilcoxon 秩和检验; Fig. 2 B，C），scRNA-seq 数据中原代样本和转移样本之间的 NK 细胞比例没有差异。此外，原代样本中 Treg 细胞 GSE21257 评分增加，这与 scRNA-seq 数据的结果相反（p < 0.05，双尾 Wilcoxon 秩和检验; Fig. 2 这可能是由于数据集的异质性造成的。批量数据集的临床信息显示，转移性和原发性样本之间的 OB 和 CB 亚型比例以及年龄没有偏差 （ Fig. 2 E-G）。在 GSE21257 和 GSE33382 中，女性在转移样本中所占的比例高于原发样本 （ Fig. 2 E-G）。
GTSE1 在 OB 细胞中表达量最高，但在基质细胞中表达量低或检测不到（ Fig. 3 A）。GTSE1 在具有不同组织病理学模式和临床行为的 OS 亚型的 GSTE1+ OB 细胞中表达，无偏倚 （ Fig. S1D, E ）。GSTE1+ OB 细胞的特征是参与核分裂、有丝分裂核分裂和染色体分离途径的基因高表达（假发现率< 0.05，超几何测试; Fig. 3 GTSE1+ OB 细胞主要分布在细胞周期的 G2、M 或 S 期，具有增强的 G2M 检查点、增殖、有丝分裂纺锤体和 DNA 修复途径活性增强（p < 0.001，双尾 Wilcoxon 秩和检验; Fig. 3 C-G）。人 OB 细胞系 MG63 和 Saos2 用于过表达 GTSE1。GTSE1 转染的 MG63 和 Saos2 细胞中 GTSE1 的蛋白和 mRNA 水平升高，通过蛋白质印迹和实时荧光定量 PCR 检测（p < 0.05，双尾学生 t 检验; Fig. 3 H-J）。如 K 和 L 所示 Figure 3 ，GTSE1 的过表达通过 CCK-8 和菌落形成测定显着提高了细胞活力并促进了生长（p < 0.05，双尾学生 t 检验 ）。
GTSE1+ OB 细胞具有高增殖活性。（A） 点图显示所有亚群中 GTSE1 的细胞比例和平均基因表达。点大小表示每个子集中表达基因的细胞比例，色谱表示 GTSE1 的平均表达水平。（B）GTSE1+ OB 细胞差异表达基因的 GO 生物过程通路富集分析。（C）OB 细胞的 t-SNE 可视化，每种颜色代表细胞周期的不同阶段。（D-G）TNC+ OB 细胞、S100A11+ OB 细胞 、GTSE1+ OB 细胞和 CTSD+ OB 细胞之间的 G2M 检查点评分 （D）、增殖评分 （E）、有丝分裂纺锤体评分 （F） 和 DNA 修复评分 （G）。（H-J）GTSE1 质粒的转染效率通过蛋白质印迹（H，I;n = 4）和定量实时荧光定量 PCR（J;n = 6）。（K） 通过 CCK-8 测定（n = 6）检查细胞活力。（L） 显示了菌落形成的图像（n = 4）。数据显示为三种独立培养物的平均值±标准差。p 值通过 （D-G） 中的双尾 Wilcoxon 秩和检验计算得出。p 值通过 （I-K） 中的双尾学生 t 检验计算。p 值采用（B）中的超几何检验计算得出。∗p < 0.05，∗∗∗p < 0.001。
在GSTE1+ OB 细胞中激活 E2F 靶通路（p < 0.001，双尾 Wilcoxon 秩和检验; Fig. 4 与富集分析一致，作者在 GSTE1 + OB 细胞中观察到 E2F4，E2F1 和 E2F7 的高活性评分（ Fig. 4 B）。除 E2F6 外，E2F 家族成员在 OB 细胞中 GTSE1+ OB 细胞中表达量最高（p < 0.001，双尾 Wilcoxon 秩和检验; Fig. 4 C-E; Figs. S2A–D ）。此外，GTSE1 的表达水平与 OB 细胞中 E2F 家族基因的活性呈正相关，尤其是 E2F4 和 E2F1（ Fig. 4 F，H; Figs. S2E–H ）。
在GTSE1+ OB 细胞中激活 E2F 靶通路。（A）TNC+ OB 细胞、S100A11+ OB 细胞、GTSE1+ OB 细胞和 CTSD+ OB 细胞中 E2F 靶通路的 ssGSEA 评分。（B）OB 细胞中排名前 20 的转录因子。深红色代表转录因子活性较高，而深蓝色表示活性较低。（C-E）E2F4（C）、E2F1（D）和 E2F7（E）在 TNC+ OB 细胞、S100A11+ OB 细胞、GTSE1+ OB 细胞和 CTSD+ OB 细胞中的表达值。（F-H）GTSE1 表达值与 E2F4（F）、E2F1（G）和 E2F7（H）活性的相关性。p 值通过双尾 Wilcoxon 秩和检验（A 和 C-E）和 Spearman 秩相关分析（F-H）计算得出。∗∗∗p < 0.001。
剪刀式分析共鉴定出 3,366 个与较差预后相关的 OB 细胞和 927 个与良好预后相关的 OB 细胞 （Fig. 5 A）。具有富集 OB 细胞，特别是 GSTE1+ OB 细胞的 OS 患者表现出较差的生存率 （ Fig. 5 B）。GSTE1 可作为 OS 的预后标志物，其高表达与较差的预后 GSE21257 相关（p = 0.048，对数秩检验; Fig. 5 所有干细胞标志物在 GTSE1+ OB 细胞中均广泛高表达（ Fig. 5 D），提示 GTSE1+ OB 细胞可能具有较高的干性。伤口愈合和 transwell 实验 24 表明，GTSE1 的过表达促进了 MG63 和 Saos2 细胞的迁移和侵袭（p < 0.05，双尾学生 t 检验; Fig. 5 E-H）。
GTSE1 的上调促进了 OB 细胞的生长、迁移和侵袭。（A） 使用 Scissor 进行批量样品表型相关性分析的细胞单细胞鉴定。剪刀在 OB 细胞中选择的细胞的 t-SNE 可视化。红点和蓝点分别是剪刀 +（预后较差）和剪刀 -（预后良好）细胞。（B） 显示剪刀式+ 细胞数与剪刀式细胞数之比的条形图。log2 比率 >0 意味着与较差的生存率呈正相关关系。（C） 按 GTSE1 表达分层的 OS 患者的 Kaplan-Meier 总生存曲线。（D） 显示 OB 细胞中干细胞标志物表达的热图。（E-H） 伤口愈合（E、F;原始放大倍数，×40;n = 5）和 transwell 测定（G，H;比例尺= 100μm;n = 5）表明，GTSE1 过表达后 OB 细胞的迁移和侵袭能力增加。数据显示为三种独立培养物的平均值±标准差。p 值采用（C）中的对数秩检验计算。p 值采用（F，H）中的双尾学生 t 检验计算。∗∗∗p < 0.001。
GTSE1 耗竭抑制 OB 细胞的生长、迁移和侵袭
作者试图评估 OB 细胞中 GTSE1 丢失对体外肿瘤生长和转移的影响。在 MG63 和 Saos2 细胞中通过 3 个独立的 siRNA 去除 GTSE1，并使用蛋白质印迹和定量实时 PCR 测定成功验证了 GTSE1 的去除效率。与相应的阴性对照相比， 在 GTSE1 耗竭的细胞中观察到 GTSE1 表达显着降低（p < 0.05，双尾学生 t 检验 ; Fig. 6 A、B）。作者选择 siRNA-2 进行后续实验。CCK-8 和集落形成实验表明，GTSE1 耗竭抑制 MG63 和 Saos2 细胞的活力和生长能力（p < 0.01，双尾学生 t 检验; Fig. 6 C、D）。GTSE1 耗竭不仅阻碍了细胞迁移（p < 0.01，双尾学生 t 检验; Fig. 6 E，F），但也削弱了入侵能力（p < 0.05，双尾学生 t 检验; Fig. 6 G，H）通过伤口愈合和 transwell 测定。
GTSE1 耗竭显著抑制 OB 细胞的生长、迁移和侵袭。（甲、乙）GTSE1 siRNA 的敲低效率通过蛋白质印迹（A;n = 4）和定量实时 PCR（B;n = 6）。（C） 通过 CCK-8 测定（n = 6）检查细胞活力。（D） 菌落形成图像（n = 4）。（E-H） 伤口愈合（E、F;原始放大倍数，×40;n = 5）和 transwell 测定（G，H;比例尺= 100μm;n = 5）表明，GTSE1 耗尽后 OB 细胞的迁移和侵袭能力降低。数据显示为三种独立培养物的平均值±标准差。p 值通过双尾学生 t 检验计算。∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001。
在 OS 样本中观察到GTSE1+ OB 细胞与单核细胞以及 CREB3L1+ CB 细胞和 DNM1+ OC 细胞的比例之间呈负相关，但 GTSE1+ OB 细胞与 CREB3L1+ CB 细胞的比例之间没有相关性（ Fig. 7 A）。作者观察到四个独立的 OS 队列 （ Fig. 7 B-E） 中 GTSE1+ OB 细胞和单核细胞的比例之间存在负相关关系。单核细胞特异性 DEGs 参与免疫应答相关通路，如 T 细胞介导的免疫和 T 细胞介导的细胞毒性通路（假发现率< 0.05，超几何试验; Fig. S3A ）。GO 富集分析显示，转移样本中 GTSE1+ OB 细胞和 T 细胞亚群（CD4−/CD8− T 细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞和 Treg 细胞）中高表达基因富集了对单核细胞迁移途径的调控（假发现率< 0.05，超几何检验; Fig. S3C, D ）。细胞间配体-受体分析显示，GTSE1+ OB 细胞和 T 细胞亚群在转移性 OS 中具有 MIF-CD74 和 COPA-CD74 对的优先相互作用（ Fig. 7 F）。此外，CellChat 显示，在转移性 OS 中，GTSE1+ OB 细胞和 CD8+ T 细胞之间的信号对数量和强度增加 （ Fig. S4A ）。GTSE1+ OB 细胞通过 MIF-（CD74-CXCR4）对在转移性 OS 中与 CD8+ T 细胞相互作用，使用两种方法（ Fig. 7 F; Fig. S4B ）。 与原发样本相比，本 RNA 转录组显示转移性 CD74 和 CXCR4 之间的正相关性更高 （ Fig. S4C ）。空间转录组学数据显示，MIF-CD74 和 CXCR4-MIF/CD74 的共表达水平在未分化多形性肉瘤中呈正相关，而在平滑肌肉瘤中相关性较低（ Fig. 7 G，H; Fig. S4D ）。以上结果表明，GTSE1+ OB 细胞、单核细胞和 T 细胞之间的信号相互作用可能有助于 OS 促转移的微环境。在 T 细胞中，CD8+ T 细胞在转移中的浸润率始终低于 scRNA-seq 和批量数据集中的原代样本 （ Fig. 2 A-D）。为了进一步说明 GTSE1+ OB 细胞、单核细胞和 CD8+ T 细胞之间的相关性，作者构建了三种细胞特异性 DEG 的相关网络（ Fig. S4E ）。在它们之间观察到复杂的调控关系，GTSE1+ OB 细胞和单核细胞、GTSE1+ OB 细胞和 CD8+ T 细胞以及单核细胞和 CD8+ T 细胞之间存在相关性 （ Fig. S4E ）。CEBPD、PTPRC、SERPINA1 和 TUBA1A 被鉴定为调控网络中的枢纽基因（ Fig. S3B ）。
GTSE1+ OB 细胞与单核细胞丰度呈负相关，而 CREB3L1+ CB 细胞在转移中与成纤维细胞的相互作用增加。（A） 饼图表示细胞子集的比例为正（p < 0.05，相关系数>0，Spearman 秩相关分析，红色），负（p < 0.05，相关系数<0，Spearman 秩相关分析，蓝色），或非显著（p > 0.05，Spearman 秩相关分析，灰色） GSE152048 相关性。黑匣子是感兴趣细胞的相关性。（B-E） 单核细胞差异表达基因分数与 GTSE1+ OB 细胞之间的 Spearman 秩相关性分析。红色密度图显示转移样本中 ssGSEA 评分的分布，蓝色密度图显示原发样本中的分布，每个点代表一个样本。（F） 转移中 GTSE1+ OB 细胞与 T 细胞亚群（CD4−/CD8−T 细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞和 Treg 细胞）之间的差异配体-受体串扰。x 轴显示组织，而 y 轴显示配体-受体对。圆圈大小代表意义，而颜色代表配体和受体的平均表达。（G） 一个样本的苏木精-伊红染色（左）和两个基因的空间共定位图像（右）。 （H）MIF-CD74 和 CXCR4-MIF/CD74 对在三个样品中的共定位之间的共表达，来源于 GSE212526 （Pearson 相关分析）。
CREB3L1+ CB 细胞在转移中表现出与成纤维细胞的相互作用增加
CREB3L1 在 CB 细胞中高表达，特别是在 CREB3L1+ CB 细胞中（ Fig. S5C ）。CREB3L1 高表达患者的 OS 总生存期较差（p = 0.002，对数秩检验; Fig. S5E ）。剪刀式分析发现，356 个 ATAD3A+ CB 细胞与较差的预后相关，但没有 ATAD3A+ CB 细胞与良好的预后相关 （ Fig. 8 A）。富集 CREB3L1+ CB 细胞和 ATAD3A+ CB 细胞的患者生存率较差 （ Fig. 8 A， B）。
CREB3L1+ CB 细胞在转移中表现出与成纤维细胞的相互作用增加。（A） 使用 Scissor 进行批量样品表型相关性分析的细胞单细胞鉴定。CB 细胞中剪刀选择细胞的 t-SNE 可视化。红点和蓝点分别是剪刀 +（预后较差）和剪刀 -（预后良好）细胞。（B） 显示剪刀式+ 细胞数与剪刀式细胞数之比的条形图。log2 比率> 0 意味着与较差的生存率呈正相关。（C） 显示了 CREB3L1+ CB 细胞和非恶性细胞（转移性样本与原代样本）之间的差异串扰。点大小代表配体-受体对的数量，满足以下要求：转移性样品中的 p < 0.05 和原发样品中的 p > 0.05。粉红色圆圈代表 GTSE1+ OB 细胞，蓝色圆圈代表非恶性细胞。（D、E）CREB3L1+ CB 细胞、FGFBP2+ CB 细胞和 ATAD3A+ CB 细胞之间的补体评分 （D） 和炎症反应评分 （E）。（F、G） 使用 Monocle3 生成的癌细胞的伪时间轨迹。（F）癌细胞的 UMAP 可视化。（G）细胞对其相应的伪时间进行颜色编码。（H） GTSE1+ OB 细胞和 CREB3L1+ CB 细胞 （转移性样品与原代样品）之间差异配体-受体串扰的热图。红色代表细胞中的表达值。 蓝色代表交互分数，而深蓝色表示更大的预测交互。配体-受体对沿左轴列出。p 值通过双尾 Wilcoxon 秩和检验 （D-E） 计算。∗∗∗p < 0.001。
CREB3L1+ CB 细胞特异性 DEGs 不仅参与细胞外基质相关通路，还参与胶原相关通路，如细胞外基质组织、细胞外结构组织和胶原生物合成过程途径（假发现率< 0.05，超几何测试; Fig. S5A ）。这些观察结果与转移性 CREB3L1+ CB 细胞与原代 CREB3L1+ CB 细胞相比上调基因一致（误发现率 < 0.05，超几何检验; Fig. S5B ）。细胞间通讯的推断表明，成纤维细胞在转移的所有差异串扰细胞类型中排名靠前（ Fig. 8 C），突出了 CREB3L1+ CB 细胞与成纤维细胞之间的频繁相互作用。此外，CREB3L1+ CB 细胞富含炎症反应和补体通路（ Fig. 8 D，E），并表现出高表达的 S100A4（p < 0.001，双尾 Wilcoxon 秩和检验; Fig. S5F ）。
CREB3L1+ CB 细胞的比例与 DNM1+ OC 细胞的比例呈负相关，DNM1+ OC 细胞与成纤维细胞也呈负相关（ Fig. 7 A）。同时，CREB3L1+ CB 细胞经常与成纤维细胞相互作用（ Fig. 8 C）。相关性分析显示，CREB3L1+ CB 细胞、DNM1+ OC 细胞和成纤维细胞之间存在复杂的调控关系 Fig. S5G （ ）。PRSS35、FGFR1 和 DNM1 已知对转移 25 26 27 有深远影响，被确定为调节网络中的枢纽基因 （ Fig. S5H ）。
轨迹和伪时间分析表明，GTSE1+ OB 细胞是癌细胞的起源，CTSD+ OB 细胞是发育轨迹中癌细胞的末端（ Fig. 8 F，G）。GTSE1+ OB 细胞与 CREB3L1+ CB 细胞之间的细胞间通讯推断显示，转移样本中 C5AR1-RPS19 和 CD74-MIF 的优先相互作用（ Fig. 8 H）。CPE 是一种在 OS 中高表达且与远处转移相关的风险基因， 28 被鉴定为 GTSE1+ OB 细胞和 CREB3L1+ CB 细胞细胞特异性 DEG 相关网络中的枢纽基因（ Fig. S5D ）。
总结
总之，作者的发现揭示了 GTSE1+ OB 细胞和 CREB3L1+ CB 细胞富集转移性 OS，以及由癌细胞和非恶性细胞驱动的协调促转移肿瘤微环境。因此，增强 GTSE1 的表达以促进 OB 细胞侵袭和转移是一种潜在的转移促进剂。
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