|
结果：
MASLD 中棕榈酰化相关基因的表达模式及共表达模块
在发现队列GSE213621 中，分析了 368 名个体的转录组档案——其中包括 69 名健康对照和 299 名代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）患者。共识别出 371 个差异表达基因（DEGs）其中包括 249 个上调基因和 122 个下调基因（图 2A）。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些 DEG 主要参与能量代谢、脂质生物合成和葡萄糖代谢过程。值得注意的是，ECM-受体相互作用、局部粘附和 TGF-β信号等通路均显著富集，表明其在细胞外基质重塑和纤维化进展中起作用。若干 DEGs 还与细胞应激反应、炎症消解和细胞周期调控相关，凸显了 MASLD 的多元分子病理学（见图 2B，C）。基因集富集分析（GSEA）进一步证明，MASLD 样本在干扰素-γ反应、Myc 靶基因和蛋白质分泌相关通路中显著富集，暗示可能存在免疫激活和代谢重编程。过氧化物酶体和氧化磷酸化途径的上调可能反映了对脂质代谢失衡和线粒体功能障碍的代偿性反应（图 2D ）。
为验证这些发现的稳健性，在独立队列（GSE130970）中重复了差异表达分析，抗凝聚酶分析表明 DEGs 在趋化因子活性、免疫细胞迁移和膜结构维持方面有所富集。KEGG 分析强调了细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号和 PPAR 信号通路的富集。GSEA显示 MASLD 样本中氧化磷酸化、脂质生成以及 PI3K–Akt–mTOR 和 TGF-β信号通路持续上调，这与主要队列的观察结果一致。总体而言，MASLD 表现出炎症激活、分泌应激和代谢重编程的显著特征。为了进一步研究 MASLD 中棕榈酰化相关基因（PRGs）的表达模式，作者从体型 RNA-seq 数据集中提取了具有已知人类表达谱的 PRGs。结果显示，MASLD 样本中 DGAT1、DGAT2、PNPLA3、PNPLA4、MOGAT2、PLIN4、LPL、CD36 和 ZDHHC5 显著上调，而 CPT1A、CPT1B、CPT2、ACOX1、HADHB 和 MTTP 则显著下调（图 2E，G）。其他基因，包括 LIPE、LIPA 和 PLSCR1，组间无显著表达差异。共表达分析显示 CPT1A、CPT1B 和 CPT2 之间呈强正相关，表明它们参与协调代谢模块。DGAT1 和 DGAT2 之间，以及 PNPLA3 和 PNPLA4 之间也观察到类似的共表达模式。相比之下，CD36 与 CPT1B、HADHB 及其他线粒体脂肪酸氧化基因呈强烈负相关，显示潜在的拮抗调控关系。 总体而言，PRGs 形成了明显的正相关簇，与负相关基因组相互作用，表明 MASLD 发病机制中存在合作或对立作用（见图 2 G）。
MASLD 中棕榈酰化相关分子特征的多组学分析。 一个火山图，显示 MASLD 组与对照组之间基因表达差异（DEGs）。红点表示基因显著上调，蓝点表示基因显著下调（|log2FC| >0.5， p < 0.05）。B KEGG 途径富集条形图，MASLD 中 DEGs。C 条形图，显示 DEG 的基因本体（GO）富集分析。D 基因集富集分析（GSEA）图，突出显示标志通路。E 采用更严格阈值（|log2FC| >1， p < 0.05）的上调、下调及无显著棕榈酰化基因的摘要条形图。棕榈酰化相关基因的 F 相关热图。点大小表示绝对相关强度，颜色表示皮尔逊相关系数（蓝色：正，红色：负）。G RainCloud 对照组 PRG 与 MASLD 组的对比图。数值以平均值表示，标准差±。RainCloud 图中的 P 值用星号表示：*P < 0.05，**P < 0.01，P < 0.001，ns 表示无显著差异。
MASLD 中基于棕酰胺化亚型的分子和功能异质性（第 1 群与第 2 群）
为研究 MASLD 的异质性，基于棕榈酰化相关基因（PRGs）的表达谱，进行了共识聚类分析。根据共识累积分布函数（CDF）和三角洲面积图，最优的聚类数量被确定为 k = 2，反映了最佳稳定性和组间明显分离（见图）。3A–C）。因此，MASLD 样本被分层为两个分子亚型：簇 1 和簇 2。两个簇之间的差异表达分析显示，相较于簇 2，第 1 簇中有 255 个上调基因和 154 个下调基因（图 3D ）。抗磷酸菌富集分析显示，这些差异表达基因（DEGs）主要与突触调控、细胞粘附和钙离子稳态相关（见图 3G）。GSEA 进一步证明，簇 1 在雄激素反应和胆固醇稳态等代谢途径中富足，而簇 2 在 KRAS 信号、Wnt/β-catenin 信号和有丝分裂过程中表现出显著丰富（图 3F ），表明两亚型在信号转导和细胞周期调控方面存在明显差异。表达模式分析显示，超过三分之二的 PRG 在不同群体之间表达差异。
具体来说，PNPLA4、DGAT2、MGLL、LIPE、ATP8B1、CETP、PNPLA3、LIPG、LIPA、CPT1A、APOE、CD36、CPT2、ACOX1、MOGAT2、PLIN4、LPL、PNPLA2 和 DGAT1 表现出高度显著差异（p < 0.001），而 LYPLA1、SLC27A1、MPP1、PPT1、HADHB、GPAT3、MTTP、LPCAT1 和 ZDHHC5 则显示中等差异（p < 0.05）（见图）。 3E）。相比之下，PRG 如 PLB1、LIPC、PLSCR1 和 PPT2 则没有统计学上显著的差异。这些发现凸显了两种亚型 PRG 表达的广泛差异，反映了棕榈酰化调控可能存在的异质性。为进一步表征每个亚型的功能特征，分别对每个簇独立进行 GSEA 分析，并可视化了前 20 条显著富集通路（见图 3H， I）。在 GO 生物过程类别中，Cluster 1 富含与组蛋白修饰、离子通道活性、神经递质转运和染色质重塑相关的通路，表明其表现型具有转录活性和信号处理导向。相反，第 2 簇在抗原加工和呈递、MHC II 类复合物组装、先天免疫反应和线粒体蛋白合成方面富集，显示免疫活性和线粒体代谢增强。KEGG 通路分析支持了这些发现：第 1 簇在昼夜节律、ABC 转运蛋白、磷脂酰肌醇信号系统、链状体和尿酸代谢中表现出丰富，突出其在代谢调控和细胞内运输中的作用。相比之下，Cluster 2 在 Toll 样受体信号、趋化因子信号、自然杀伤（NK）细胞激活及自身免疫疾病相关通路方面显著丰富，反映出明显的免疫炎症特征。总体而言，第一群以代谢调控和信号转导为特征，而第二群则主要表现出免疫驱动的表型。这些结果表明，这两种 MASLD 亚型在棕榈酰化调控网络中参与不同的生物学程序。
分子亚型分析揭示了与棕榈酰化和免疫信号传导相关的转录和功能差异。在k = 2–6 时，CDF 曲线下的面积分数。横轴表示类别数（k），纵轴表示 CDF 曲线下面积的相对变化。B 的 CDF 曲线显示共识分布范围为 k=2 至 k=6。C 共识聚类矩阵图显示了 k = 2 时的聚类结果。D 火山图显示簇 1 与簇 2 之间差异表达基因（DEGs）（|log2FC| >1， p < 0.05）。E 盒图比较了第 1 簇和第 2 簇之间共识棕榈酰化基因的表达。P 值以星号表示（*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001， 注：无显著性）。F 基因集富集分析（GSEA）结果显示簇 1 与簇 2 之间存在显著的标志性通路，G GO 富集条形图比较簇 1 和簇 2。代表性 GO（H）和 KEGG（I）项的 H-I 亚型分布图，显示了簇间通路活动的差异。
本研究首次采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算大体转录组数据集中每个 MASLD 样本的棕榈酰化相关基因集（PRG）分数。这些由 ssGSEA 得出的评分作为后续加权基因共表达网络分析（WGCNA）的表型性状，旨在识别与 PRG 活性显著相关的基因模块。构建的 WGCNA 网络产生了 24 个不同的共表达模块，每个模块都标注了独特的颜色（见图）。4B）。模块特征基因与 PRG 分数的相关分析确定黄色模块（MEyellow）关联最强（皮尔逊相关系数=0.65;图 4 C）。为了进一步优先考虑具有潜在调控作用的候选基因，MEyellow 中的 511 个基因与两组差异表达基因（DEGs）交叉：（1）MASLD 与正常样本之间的 DEGs;以及（2）群 1 与群 2 之间的 DEGs。该交汇点鉴定出 13 个候选枢纽基因，表现出差异表达和强模块成员关系。为了优化这些候选者的生物标志物选择，构建并评估了一组全面的机器学习模型。以 GSE213621 为训练队列，采用 10 折交叉验证评估 113 个模型组合，随后在三个独立数据集（GSE135251、GSE130970 和 GSE126848）进行外部验证。
该模型结合了逐步广义线性建模（Stepwise GLM）与线性判别分析（LDA），在各队列间表现出稳健且一致的性能，平均 AUC 约为 0.77（图 4A）。 进一步的性能评估显示 MASLD 识别灵敏度较高（范围为 79.61%至 97.66%），尽管特异性存在差异，部分数据集中观察到较低的数值（例如 GSE135251 的 10.0%）。尽管如此，该模型在训练集中准确率达到 89.13%，F1 分数在所有验证队列中均超过 78%，强调了其判别能力（图 4 G）。特征重要性分析确定 COX6A1、COX7A2 和 NDUFA4 为关键枢纽基因。ROC 曲线分析进一步支持了其诊断潜力，GSE213621 数据集中 AUC 值超过 0.75（图 4D）。开发了一个包含这三个基因的逻辑回归模型，用于个体化风险预测，并以数字图（图 4E）形式可视化，预测了一个风险概率为 83.2%的示例病例。此外，决策曲线分析（DCA）显示，该模型在 0.1 至 0.75 的阈值概率范围内，相较于“全治”或“不治疗”策略，带来了更高的临床净益处（见图。 4F），暗示其在临床决策中的潜在应用。
对枢纽棕榈酰化相关基因及机器学习模型的诊断性能进行全面评估。对集成 Lasso、ElasticNet、Random Forest（RF）、Stepwise GLM 及其他多种机器学习模型的性能比较 。模型按曲线下的面积（AUC）进行排名。B WGCNA 模块-性状关系热图。C 维恩图显示了多项分析中差异表达基因（DEGs）的交集情况。三个代表性基因（COX6A1、COX7A2 和 NDUFA4）的 D ROC 曲线显示其诊断效力。基于 COX6A1、COX7A2 和 NDUFA4 构建的 E 型组图模型，用于个体化 MASLD 风险预测。F 决策曲线分析（DCA），评估逻辑模型在不同阈值概率下 MASLD 诊断的临床效用。G 跨训练和外部验证队列的诊断模型绩效评估。
为阐明由棕榈酰化相关基因（PRG）表达定义的 MASLD 亚型间免疫微环境差异，作者进行了全面的免疫相关分析，比较了第 1 簇和第 2 簇（见图）。5A–D）。免疫细胞浸润分析显示，Cluster 2 显著富含多种免疫细胞群体，包括多个 T 细胞亚群（CD4⁺/CD8⁺ 天生细胞、记忆细胞和效应细胞）、B 细胞（初生细胞、记忆细胞和血浆细胞）、自然杀手（NK）细胞、树突状细胞、肥大细胞和单核细胞。第 2 簇还表现出特别高比例的 M0 和 M2 巨噬细胞，表明其免疫反应增强和炎症调节活性（见图 5A）。进一步的免疫功能评分显示，Cluster2 在多个通路中显著升高，包括 CCR 信号传导、T 细胞共刺激、HLA 表达、副炎症和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）丰度，表明免疫状态处于全球激活状态（图 5B）。关于免疫调节分子，关键因子如 CD274（PD-L1）、CD276（B7-H3）、TGFB1 和 CXCL10 在 Cluster 2 中显著上调。
这些分子已知参与免疫检查点调节、TGF-β介导的免疫抑制以及趋化信号传导，凸显了该亚型中免疫激活和调控的复杂性（见图 5C）。相比之下，第 1 簇的免疫相关基因表达普遍较低，表明其表现型相对“免疫沉默”。相关分析进一步揭示，已识别的枢纽基因（COX6A1、COX7A2 和 NDUFA4）与多种免疫功能评分呈显著负相关（见图。 5D），这意味着代谢活动的增强可能与免疫抑制特征有关。综合来看，这些发现凸显了两种基于 PRG 的 MASLD 亚型之间的免疫学异质性。第二簇以免疫激活和炎症参与为特征，而第一簇则表现出代谢活跃但免疫系统静止的特征，表明 MASLD 亚型间存在明显的代谢-免疫耦合模式。
免疫景观分析及枢纽棕榈酰化相关基因的免疫学关联。 热图显示了簇 1 和簇 2 样本中各种免疫细胞类型估计比例，采用多重免疫解卷积算法计算。采用 B ssGSEA 方法考察各亚组的免疫浸润模式和通路激活状态。C 热图展示了免疫检查点基因和免疫调节基因的表达模式。D：枢纽基因与免疫相关通路或特征之间的相关分析，包括 TILs、HLA、趋化因子（CCR）和副炎症。
鉴于肝细胞类型——包括实质细胞、内皮细胞和免疫细胞——在代谢功能障碍相关脂肪化肝病（MASLD）的发病机制和纤维化进展中的关键作用，作者分析了单细胞 RNA 测序数据集，GSE136103 以界定肝组织中细胞亚型特异性的转录组特征。经过标准化和使用 Seurat 工作流程处理后，共识别出 11 种不同的单元类型（见图）。6A），包括巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、内皮细胞、NKT 细胞、上皮细胞、肝细胞、B 细胞、T 细胞、平滑肌细胞（SMCs）和树突状细胞。图 6B 展示了前五个代表性标记基因及每种细胞类型中阳染色细胞的比例。此外，UMAP 可视化（图 6C）揭示了典型标记基因[41]的空间分布，如 EPCAM、DLGAP5、TAGLN、CALD1 和 CD3D/E，这些基因与各自的细胞簇高度吻合。为探讨每个细胞群体在 MASLD 和肝硬化中的潜在功能作用，作者进行了基因本体（GO）富集分析（见图）。
6 结果凸显了细胞类型间显著的功能异质性。具体来说，巨噬细胞富含与 MHC II 类受体活性、抗原结合和免疫球蛋白受体结合相关的通路，表明其在免疫调控和炎症反应中起关键作用。单核细胞富含细胞因子结合和免疫反应调节通路，凸显了它们在塑造肝脏免疫微环境中的作用。 上皮细胞在细胞间粘附和酶抑制活性方面表现出显著富集，表明其在屏障功能和组织修复中起作用。内皮细胞富含趋化因子受体结合和免疫受体活性，可能促进血管生成和免疫细胞运输。肝细胞与免疫受体活性和 MHC-II 介导的抗原呈现相关，表明其作用超越代谢。作者进一步研究了关键基因 NDUFA4、COX6A1 和 COX7A2 在不同肝细胞类型的表达模式。如图所示。6 这些基因在肝细胞、巨噬细胞和内皮细胞中高度表达，且其表达水平在 MASLD 患者样本中显著上调（见图）。6F). 统计分析证实，疾病组中这三个基因均显著升高于对照组，暗示它们可能参与 MASLD 的进展。
MASLD 关键诊断基因的单细胞转录组景观和表达模式。通过标记基因显示细胞类型的 t-SNE 图。B 点图显示每个细胞簇的前五个标记基因。C 单细胞表达图展示了标注细胞群中典型标记基因的表达水平和分布，确认细胞身份。D 基因本体（GO）免疫细胞类型的富集分析。E Violin 绘制了 COX6A1、COX7A2 和 NDUFA4 在不同细胞类型的表达图。F 箱形图，比较疾病组与对照组间 COX6A1、COX7A2 和 NDUFA4 的表达。（****P < 0.0001， ***P < 0.001， **P < 0.01， *P < 0.05， ns = 不显著）
肝细胞亚群中枢基因的表达特征及其在 MASLD 进展中的功能验证
鉴于肝细胞中已识别的枢纽基因表达显著升高，作者通过在肝细胞群体中进行降维和聚类分析，进一步探讨了它们在 MASLD 进展中的潜在作用。基于亚群体特异性标记基因的表达，识别出四个肝细胞亚簇，分别命名为 RPS4Y1/、ONECUT1⁺、APOC2/和 CEACAM6⁺（见图）。
7A，B）。其中，ONECUT1 亚簇占最大比例，并被发现是枢纽基因表达的主要位点（图 7B）。肝细胞亚簇在健康组与 MASLD 组之间的分布显示出显著的组成变化，尤其是疾病组中 ONECUT1⁺族群的增加（图 7A），表明疾病进展过程中存在动态细胞重塑。对枢纽基因表达模式的详细分析（图 7C、D）显示，NDUFA4、COX6A1 和 COX7A2 在 MASLD 样本中显著上调，其表达主要在 ONECUT1⁺亚簇中富集。为验证这些转录组发现，作者在 MCD 和 HFD 小鼠模型肝组织上进行了多重免疫荧光染色。由于 COX6A1 和 COX7A2 都编码细胞色素 c 氧化酶（COX）复合体的亚基，作者重点关注 COX6A1 和 NDUFA4 的表达。结果证实，NDUFA4、COX6A1 和 ONECUT1 在 MCD 和 HFD 小鼠的肝脏中均显著上调（见图 7E–H），支持这三个枢纽基因在 MASLD 发病机制和进展中的功能激活作用。
肝细胞亚群中枢基因的表达及功能验证，促进 MASLD 进展。 对对照组和疾病组肝细胞亚群的 UMAP 聚类，识别出四个不同的聚类：RPS4Y1/、ONECUT1⁺、APOC2/和 CEACAM6⁺。 肝细胞亚群中枢纽基因（COX6A1、NDUFA4、COX7A2）的表达，ONECUT1⁺亚群表达最高，表明枢纽基因在该簇中主要富集。C 对照组与疾病组之间 NDUFA4、COX6A1 和 COX7A2 的表达差异。D 箱型图比较肝细胞亚群中枢基因（NDUFA4、COX6A1、COX7A2）的表达。E–HMCD 和 HFD 小鼠模型中的多重免疫荧光分析，显示 NDUFA4、COX6A1 及肝组织中 ONECUT1 表达的上调。这些发现支持这些枢纽基因在 MASLD 进展中的功能激活。
为探讨肝细胞中枢纽基因表达是否与 MASLD 细胞间通信改变相关，作者采用 CellChat 框架，基于单细胞 RNA-seq 数据的配体-受体相互作用模型分析细胞间通信网络。如图所示。8A 和 B，MASLD 进展过程中不同细胞群体之间的整体通讯强度增强。值得注意的是，肝细胞与其他细胞类型——尤其是内皮细胞和单核细胞——之间的相互作用在疾病状态下增强，表明肝细胞在炎症和免疫反应中的作用更为活跃。此外，巨噬细胞与 B 细胞和 T 细胞之间的通讯也显著增强，凸显了它们在免疫调节中的作用（图 8C）。进一步分析显示，NDUFA4⁺肝细胞在 MASLD 样本中与免疫细胞——包括巨噬细胞、B 细胞、T 细胞和单核细胞——的通讯显著增强。这些相互作用主要通过信号轴（如 MIF、TNF、CXCL 和 SPP1）介导（见图 8D）。指向 NDUFA4⁺肝细胞的信号特别强烈，表明免疫微环境可能通过特定信号通路调节肝细胞功能。
同样，COX6A1/肝细胞在疾病条件下与巨噬细胞、B 细胞和 T 细胞的双向通信增强，参与 MIF 和 TNF 信号通路。值得注意的是，主要输入信号来自巨噬细胞和树突状细胞，而 COX6A1/肝细胞的输出信号则显示其有能力向免疫群体传递调控信号（见图 8E）。 相比之下，COX7A2⁺肝细胞表现出相对有限的细胞间通讯活动。尽管如此，它们与树突状细胞、巨噬细胞和 B 细胞的相互作用依然显著，主要依赖 MIF 和 TNF 等关键通路进行细胞间信号传递（见图 8F）。尽管参与程度略低于 COX6A1⁺肝细胞，但 COX7A2⁺细胞在 MASLD 的免疫反应调控中仍可能发挥重要作用。
MASLD 进展中的枢纽基因表达与细胞间通讯。A–B 利用 CellChat 工具进行细胞间通信网络分析，描绘 MASLD 进展过程中不同细胞类型间的通信强度。C 型巨噬细胞与疾病组中的 B 细胞和 T 细胞的通信显著增强，表明其在免疫调节中起关键作用。疾病组中的 D NDUFA4⁺肝细胞与免疫细胞（巨噬细胞、B 细胞、T 细胞和单核细胞）表现出活跃的通信，涉及 MIF、TNF、CXCL 和 Spp1 信号通路。E COX6A1⁺肝细胞通过 MIF 和 TNF 信号与巨噬细胞、B 细胞和 T 细胞的双向通信增强。F COX7A2⁺肝细胞与树突状细胞、巨噬细胞和 B 细胞的通信有限但显著，依赖 MIF 和 TNF 信号通路。
为评估枢纽基因在 MASLD 中的潜在诊断价值，作者建立了 MCD 和 HFD 小鼠模型，以模拟 MASL 和 MASL 的不同阶段（MASL 和 MASH）。经过 20 周的高脂饮食（HFD）和 8 周甲硫氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）治疗后，作者通过 H&E、Oil Red O 和 Masson 染色评估肝组织形态变化。结果显示 HFD 组存在显著的肝脂变和局灶性炎症，而 MCD 组则表现出更严重的肝损伤，包括脂质积累、细胞结构破坏和明显的纤维化（见图）。9A）体重和肝脏重量分析显示高脂饮食组的体重和肝重显著增加，表明高脂饮食可能诱导肥胖和脂肪肝形成。相比之下，MCD 组体重增加有限，晚期体重和肝重均下降，反映肝损伤更为严重。血清生化分析显示两种模型中 ALT 和 AST 水平显著升高，暗示肝功能受损;同时，总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平升高，但 MCD 组的水平低于 HFD 组，表明两种模型均存在脂质代谢异常，HFD 更易引起高脂血症。进一步检查包括 RT-qPCR（图 9D、E）、免疫组化（图 9F）和西方印迹（图）。 9B， C）显示 HFD 组和 MCD 组肝组织中 NDUFA4 和 COX6A1 表达均显著上调，与之前生物信息学分析和验证集 GSE130970 的结果一致。此外，还在肝炎 G2 细胞中进行了体外实验，使用棕榈酸（PA）诱导脂质积累。治疗 48 小时后，西方印迹（图 9G）和 RT-qPCR（图 9H）结果显示 NDUFA4 和 COX6A1 表达显著增加，进一步支持其在肝脂肪变期间的上调。
验证小鼠和细胞模型中枢基因表达及细胞间通信。 一项代表性肝脏组织染色，针对 NCD（20 周）、HFD 和 MCD 小鼠在 8 周和 20 周时的染色，包括 H&E、Oil Red O 和 Masson’s Trichrome 染色。来自非传染性病（20 周）和高脂蛋白组肝组织中 NDUFA4 和 COX6A1 的 B 蛋白表达水平。来自 NCD（8 周）和 MCD 组肝组织中 NDUFA4 和 COX6A1 的 C 蛋白表达水平。来自 NCD（8 周）和 MCD 组肝组织中 NDUFA4 和 COX6A1 的 D mRNA 表达水平。肝脏组织中 NDUFA4 和 COX6A1 的 E mRNA 表达水平（20 周）和高脂腺功能组。进行了免疫组化染色以评估肝组织中 NDUFA4 和 COX6A1 的表达水平。来自 CON 和 PA 组的肝炎 G2 细胞中，NDUFA4 和 COX6A1 的 G 蛋白表达水平。来自 CON 组和 PA 组的 HepG2 细胞中 NDUFA4 和 COX6A1 的 H mRNA 表达水平。所有数据均以平均值±标准差显示。**： p < 0.01， ***： p < 0.001。
细胞色素 c 氧化酶（COX）是线粒体呼吸链复合体 IV（RCC IV）的末端酶，是一种关键的跨膜复合物，负责维持肝脏稳态。先前研究表明，缺乏 COX 的肝细胞在应激条件下更易发生细胞凋亡[42]。同样，缺乏核编码亚基 COX6A1 的小鼠表现出明显的肝功能障碍，强调其在肝脏生理中的重要作用[43]。为研究该枢纽基因的机制参与，使用 siRNA 在 HepG2 细胞中沉默 COX6A1，实现了显著的敲低效率（见图）。10A，B）。在棕榈酸（PA）处理下，Oil Red O 和 Nile Red 染色显示 COX6A1 耗损细胞中脂滴数量和大小均显著减少（见图）。10C），表明在脂质代谢中起着关键作用。对肝细胞的伪时间分析描绘出从健康状态到病变状态的轨迹，伴随着明显的转录转变（图）。10D）。COX6A1 的表达沿病菌分支显著增加（图。10F），暗示其与细胞状态的进展有关。CytoTRACE 分析显示，大多数肝细胞处于晚分化状态（见图。10G）。沿轨迹动态基因表达的热图显示，富含 p53 信号和程序性细胞死亡的 Cluster 3 基因与疾病发展密切相关（见图）。10E）。基因本体论（GO）和 KEGG 途径富集分析指向 p53 依赖性凋亡信号，表明 COX6A1 作为线粒体呼吸的关键组成部分，可能通过调节细胞能量稳态来影响 p53 介导的细胞命运决策。 在作者的系统中，COX6A1 似乎促进脂毒性、p53 依赖性的凋亡;因此，破坏 COX6A1 通过减弱而非激活 p53 信号来起到细胞保护作用。Western blot 分析支持这一假设：PA 处理的对照 HepG2 细胞显示 p53 蛋白水平显著上升，而 COX6A1 敲低则显著抑制了 PA 诱导的 p53 上调（见图）。10 这些发现表明，COX6A1 沉默能减弱脂肪酸诱导的 p53 活化，可能通过线粒体代谢的改变，从而在脂毒性条件下减少凋亡。
COX6A1 在肝细胞脂质代谢及 MASLD 进展中的作用。A–B siRNA 介导的 COX6A1 在 HepG2 细胞中被敲低，这一点通过蛋白质（A）和 mRNA（B）表达水平的降低得到证实。 尼罗河红和油红 O 染色显示，在 PA 诱导条件下，COX6A1 敲低细胞脂滴数量和大小减少，暗示 COX6A1 在脂质代谢中的作用。D 对肝细胞的伪时间分析揭示了从健康状态到疾病状态的动态基因表达变化。肝细胞分化过程中基因簇的 E KEGG 和 GO 富集分析。肝细胞分化过程中 COX6A1 表达的 F 假时间分析。G CytoTRACE 分析显示细胞发育阶段与多样性之间的关系，细胞主要处于后期分化状态。在 PA 诱导条件下，对 COX6A1 敲低肝炎细胞中 p53 表达进行 H Western 印迹分析，显示 p53 表达显著抑制。所有数据均以平均值±标准差显示。**： p < 0.01， ***： p < 0.001。
COX6A1 敲低作用缓解 PA 诱导的线粒体功能障碍和凋亡
为评估不同治疗条件下的凋亡，进行了流式细胞术分析，比较棕榈酸（PA）诱导后 si-NC、si-COX6A1-2 和 si-COX6A1-3 组的凋亡水平。结果表明，PA 显著诱导了 HepG2 细胞的凋亡，而 COX6A1 敲低则显著减弱了这种促凋亡效应（见图）。11A）。尽管 COX6A1——线粒体呼吸链复合体 IV 的关键亚基——通常被认为是维持线粒体完整性的关键，其缺乏通常与线粒体功能障碍和细胞应激相关[44]，但作者的脂肪酸诱导模型揭示了 COX6A1 沉默后出现的矛盾细胞保护效应。作者假设这一保护性结果可能源于 COX6A1 敲低引起的代谢重编程，该重编程减少线粒体活性氧（ROS）的产生，抑制 p53 信号通路的激活，从而减轻 PA 引起的氧化应激和下游凋亡级联反应。为验证该假设，作者使用 JC-1 染色法评估线粒体膜电位（ΔΨm）。PA 处理显著降低红绿荧光比，表明ΔΨm 去极化，而 COX6A1 降序则显著恢复了膜电位完整性（见图）。11 此外，使用 MitoSox Red 测量线粒体 ROS（mtROS）水平，PA 显著提高，COX6A1 沉默则显著抑制（见图）。11C）。透射电子显微镜进一步证实 COX6A1 敲低能缓解 PA 引起的线粒体肿胀和结构破坏，支持其在保持线粒体稳态中的作用（图。11D). 基于这些观察，作者分析了参与线粒体凋亡途径的关键蛋白表达，包括 BCL2、BAX、Caspase-9 和 Caspase-3。Western 印迹分析显示，PA 暴露会上调促凋亡蛋白（BAX、Caspase-9 和 Caspase-3），并下调抗凋亡蛋白 BCL2。相反，COX6A1 降序逆转了这些效应，降低了 BAX、Caspase-9 和 Caspase-3 的表达，同时提高了 BCL2 水平（见图）。11E). 综合来看，这些发现表明 COX6A1 的耗竭通过抑制线粒体凋亡来减轻 PA 引起的肝细胞损伤，很可能是通过减少 ROS 产生和线粒体功能的保留来实现的。
COX6A1 敲低作用缓解肝炎细胞中 PA 诱导的线粒体功能障碍和凋亡。PA 诱导后 si-NC、si-COX6A1-2 和 si-COX6A1-3 组细胞凋亡水平的流式细胞术分析。COX6A1 的敲低显著减轻了 PA 诱导的凋亡。利用 JC-1 染色进行B 线粒体膜电位（ΔΨm）分析。PA 处理导致ΔΨm 去极化，而 COX6A1 敲低则恢复了膜电位完整性。使用 MitoSOX Red 测量的 C 线粒体活性氧（mtROS）水平。PA 处理显著增加 mtROS，而 COX6A1 敲低抑制了该增加。D 透射电子显微镜显示 PA 处理细胞中线粒体肿胀和结构破坏，这些问题通过 COX6A1 敲低得到缓解。对 PA 处理的 HepG2 细胞中凋亡相关蛋白（BCL2、BAX、Caspase-9 和 Caspase-3）进行 Ewestern 印迹分析。COX6A1 的降级逆转了 PA 诱导的这些蛋白质变化，减少了促凋亡标志物，增加了抗凋亡标志物。所有数据均以平均值±标准差显示。**： p < 0.01， ***： p < 0.001。
总结
本研究确认 COX6A1 是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）进展的关键调控因子，并提出其潜在治疗靶点。通过全面的多组学分析，作者强调棕榈酰化相关基因（PRGs）在调节 MASLD 代谢和免疫景观中的关键作用。研究界定了两个不同的分子亚型，即第 1 簇和第 2 簇，其中第 1 簇主要参与代谢调控，第 2 簇表现出增强的免疫激活。值得注意的枢纽基因，如 COX6A1、COX7A2 和 NDUFA4，展现出显著的诊断潜力，并影响了免疫细胞浸润和线粒体功能障碍。值得注意的是，COX6A1 体外降压降低了脂质积累，改善了线粒体功能，减少了凋亡，显示出其治疗潜力
|
