导语
单细胞转录组学揭示了胃癌样本中不同的细胞组成
总共对来自 24 例胃癌样本的 116,443 个细胞进行聚类和分类，分为 31 个不同的簇（图1A, B）。这些簇根据特定标记基因注释为九类：T 细胞（CD3D, CD3E）、浆细胞（IGHA1, IGHG1）、B 细胞（CD79A, MS4A1）、内皮细胞（EPCAM, KRT19）、成纤维细胞（COL1A2, DCN）、髓系细胞（MRC1, CD163）、血管内皮细胞（PECAM1, VMF）、增殖细胞（TOP2A, CENPF）和肥大细胞（KIT, TPSB2）（图 1C, D）。值得注意的是，胃癌样本中内皮细胞比例高的同时，成纤维细胞比例低，反之亦然（图 1E）。胃癌是一种起源于胃黏膜内皮细胞的恶性肿瘤。因此，作者对胃癌中的 12,912 个内皮细胞计算了 CNV 分数，识别出 9,792 个恶性内皮细胞和 3,120 个非恶性内皮细胞（图 1F）。如图 1E 和 G 所示，成纤维细胞比例较高的胃癌样本中，恶性内皮细胞比例也较高。因此，本研究随后集中对成纤维细胞和内皮细胞进行表征。
单细胞转录组学揭示了胃癌样本中的不同细胞组成。A UMAP 图显示了细胞的来源。B 细胞分组结果。C 细胞注释结果。D 标记基因表达。E 每个样本中细胞的比例。F InferCNV 结果。G 每个样本中恶性细胞的比例
成纤维细胞的亚聚类和注释
作者重新聚类了总共 17,144 个成纤维细胞，并根据其标记基因表达鉴定出六种不同的细胞类型：炎症性成纤维细胞（iCAFs，CFD）、周细胞（FRZB）、基质成纤维细胞（mCAFs，POSTN）、抗原呈递成纤维细胞（apCAFs，HLA-DRB1）、平滑肌细胞（SMCs，MYH11）和增殖性成纤维细胞（pCAFs，TOP2A）（图 2 A–C）。值得注意的是，具有高比例恶性 ECs 的胃癌样本，如肿瘤 1、肿瘤 4 和肿瘤 8，表现出 iCAFs、apCAFs 和周细胞亚群的增加（图2 D）。作者鉴定了所有六个成纤维细胞亚群中的差异表达基因（DEGs），以阐明四种成纤维细胞亚群的不同作用（图 2 E）。GO 和 KEGG 富集分析显示，成纤维细胞亚群中表达水平升高的基因与对机械刺激、活性氧、上皮细胞增殖、免疫系统活性和细胞迁移的反应相关（图 S1）。随后，作者使用 AUCell 算法研究了成纤维细胞的异质性，该算法基于 Lavie 等人总结的成纤维细胞的功能特征（图 2 F）。 iCAFs 在免疫相关功能中表现出最高活性，包括补体激活、趋化因子产生和炎症反应（图 2 F）。相反，apCAFs 在干扰素 I 型（IFN-I）产生和趋化因子产生等生物学过程中显著富集（图2F）。此外，mCAFs 在血管生成、伤口愈合、细胞外基质（ECM）组织调节和胶原生物合成等生物学过程中表现出富集（图 2 F）。有趣的是，除了参与细胞周期外，pCAFs 还参与 IFN-I 产生（图 2 F）。转录因子分析结果表明，胃癌中 mCAFs、iCAFs、pCAFs 和 apCAFs 的关键调节转录因子分别为 ETV4、MYB、E2F8 和 ETV5（图 2G）。
成纤维细胞的亚群分群和注释。A UMAP 图显示了成纤维细胞的来源。B 成纤维细胞亚群细胞的细胞分组结果。C 成纤维细胞亚群细胞的注释结果。D 每个样本中成纤维细胞亚群细胞的比例。E 每个成纤维细胞亚群中标记基因的表达情况。F AUCell 评分的通路活性热图，显示了每个 CAF 亚型的通路活性。G 散点图显示了每个成纤维细胞亚型中转录因子的调控子特异性得分（RSS），并突出了前五个转录因子。H 每个 CAF 亚型的轨迹分析结果
CAF 特性的复杂性可归因于其高度异源的起源。除了由组织驻留成纤维细胞转化而来，周细胞也是 CAF 的一个重要来源。通过轨迹分析，提出了一个从周细胞到 iCAFs、mCAFs、apCAFs 和 pCAFs 的潜在转化途径（图2H）。CAF 亚群表现出不同的分化模式和转录抑制。细胞命运 1 主要表达与上皮间质转化相关的基因，而细胞命运 2 不仅显示出上皮间质转化相关基因的高表达，还显著表达与炎症反应相关的基因（图 S2）。这些差异可能归因于其复杂的起源。
细胞间相互作用
CellChat 被用于描绘由 scRNA-seq 衍生出的复杂细胞间网络。图3A 和 B 展示了胃癌样本中不同细胞群体间的细胞间通讯。这种通讯主要涉及 iCAFs、恶性上皮细胞、mCAFs 和 pCAFs，每种细胞类型表现出不同数量和强度的相互作用。值得注意的是，恶性 ECs 与周围细胞之间的相互作用数量和强度显著高于正常 ECs。CellChat 可以利用 scRNA-seq 数据预测细胞信号通路中传入（受体）和传出（配体）的活动，同时考虑配体-受体复合物的多聚结构以及辅助因子与配体-受体动态的相互作用。为每种细胞群体呈现预测的传入和传出通路信号。一个通路中传出和传入信号的交集，无论是在群体内部还是群体之间，都表明可能通过该通路发生相互作用。不同细胞群体在传出信号模式中表现出不同水平的相对信号强度，如图 3C 和 D 所示。 值得注意的是，恶性内皮细胞（ECs）的传出和传入信号水平均高于正常内皮细胞。此外，配体-受体对分析表明，恶性内皮细胞通过 MDK-NCL、MDK-SDC2、PRSS3-F2R 和 MDK-LRP1 优先与癌相关成纤维细胞（CAF）亚群进行交流，而正常内皮细胞倾向于通过 MIF-ACKR3 与一部分 CAF 进行交流（图 3E）。此外，间质型癌相关成纤维细胞（mCAFs）和促炎型癌相关成纤维细胞（pCAFs）优先利用 PTN-NCL 和 MDK-NCL 与内皮细胞进行交流，其对恶性内皮细胞的交流作用比正常内皮细胞更强（图 3F）。
细胞间相互作用。热图显示了细胞间相互作用的数量（A）和强度（B）。纵轴代表发出信号的细胞，横轴代表接收信号的细胞。颜色越深，强度越强。热图显示了细胞接收信号（C）和发出信号（D）所涉及的通路。横轴代表细胞类型，纵轴代表信号通路。颜色越深，接收（发出）通路的强度越强。E 上皮细胞到 CAF 的配体-受体对（上皮细胞发出的信号，CAF 接收的信号）。F CAF 亚群到上皮细胞的配体-受体对（CAF 发出的信号，上皮细胞接收的信号）周细胞是形成促纤维化成纤维细胞、促肿瘤成纤维细胞和免疫抑制性成纤维细胞的关键来源
此外，作者利用 Seurat 将单细胞测序数据与空间转录组数据整合，从而重建了空间单细胞图谱。即使在缺乏来自同一患者的对应 scRNA-seq 数据的情况下，共嵌入结果也表明空间转录组数据在很大程度上被 scRNA-seq 数据所包含（图4 A–C）。
胃癌组织切片的空间注释和轨迹分析结果。A–C，胃癌组织切片的空间注释结果。D–F，CAF 亚群的空间分布特征。G–I，CAF 亚群伪时间分析的空间分布特征。J 空间切片中 CAF 亚群伪时间分析结果
为确定 CAF 亚群的空间分布特征，作者将其细胞亚群标注信息整合到 Seurat 对象中。 观察结果显示，CAF 亚群的高密度区域存在空间排他性（图 4 D–F），表明 CAF 的激活状态与其在 TME 中的定位之间存在相关性。 为探究每个 CAF 亚群高密度区域的空间表达动态，作者在所有切片中进行了空间轨迹分析（图 4G–J）。 结果显示，轨迹沿线的细胞类型和比例都呈现逐渐变化的趋势。 这一结果与 scRNA-seq 数据的时间分析一致，表明周细胞是形成 apCAFs、mCAFs 和 iCAFs 的关键来源（图 4 J）。
空间细胞相互作用
由于 mCAFs、iCAFs 和 pCAFs 的细胞比例较低，作者将分析重点集中在恶性肿瘤细胞与 TME 内的 apCAFs 之间的相互作用（图5A）。结果表明，恶性肿瘤内皮细胞与 apCAFs 之间的相互作用数量增加，其中 9 个切片中有 7 个表现出这种相互作用（图5B）。进一步分析揭示了恶性肿瘤细胞与 apCAFs 之间的配体-受体相互作用（LRIs），例如 PRSS3-F2R、MDK-LRP1 和 SEMA3B-NRP2-PLXNA3 等（图 5B, C）。功能富集分析结果表明，这些配体在细胞生长、细胞因子结合、补体和炎症通路中发挥着重要作用（图5 D–F）。作者发现 F2R、NRP1、NRP2 和 SDC2 在肿瘤与正常样本之间存在显著差异表达，这四基因与胃癌患者的预后相关。此外，作者使用这四基因构建了一个风险评分模型：风险评分 = 0.005001 × F2R + 0.035099 × NRP1 + 0.008414 × NRP2 + 0.012444 × SDC2。与低风险组相比，高风险组在多个独立数据集中与胃癌患者的不良预后相关（图5 G). 这表明某些配体-受体对可能在胃癌的进展和预后中发挥关键作用。
通过旁分泌信号通路，CAF 对肿瘤微环境的影响。A 热图展示了胃癌 2 样本空间切片中细胞间的相互作用。B 恶性细胞和 apCAF 的关键配体-受体对，横轴为相应的切片信息。C 在 9 个组织中，从恶性上皮细胞到 apCAF 的配体-受体相互作用（LRI）的综合排名。D、E、F GO、KEGG 和 Hallmark 富集分析的结果。G 低风险和高风险胃癌患者的总生存率
apCAFs 与癌细胞在空间上紧密相邻
为了进一步阐明 apCAFs 与癌细胞之间的空间关系，作者使用 mIHC 检测方法对整个肿瘤组织切片进行了分析。apCAFs 被鉴定为同时表达 CD74 和 PDGFRα的细胞。作者的研究发现，胃癌组织中存在大量的 apCAFs，这些双阳性细胞靠近癌细胞，这一点通过 Pan-CK 阳性得到证实（图 6）。这些观察结果表明 apCAFs 与胃癌细胞之间可能存在相互作用，这可能对肿瘤微环境和免疫反应具有重大意义。
多重免疫荧光揭示了促纤维化成纤维细胞（CD74 和 PDGFRα双阳性）与肿瘤细胞（全角蛋白阳性）的空间邻近性。
总结
本研究详细描述了胃癌内的细胞异质性和空间组织结构，揭示了 CAFs 的分类、潜在功能、起源及其与恶性 ECs 的相互作用。重要的是，作者在胃癌组织中发现了大量 apCAFs，这些细胞与癌细胞紧密相邻。本研究阐明了 CAFs 的异质性及其在胃癌中的作用，为 CAFs 的起源及其在肿瘤进展过程中的空间动态提供了新的见解。未来的研究应整合多组学数据（如蛋白质组学和代谢组学），以全面阐明 CAFs 在肿瘤微环境中的机制，从而为开发新的治疗策略提供更系统的生物学基础 。