导语

结果：

加权基因共表达网络分析
作者的分析揭示了基因之间的强相关性，相关系数超过 0.9，表明它们适合构建多个基因模块，使用 β = 14 的软阈值。为了根据基因的表达谱捕捉基因之间的相似性，作者通过计算相关性和邻接矩阵构建了一个 TOM。生成的基因簇树直观地表示基因之间的层次结构关系和聚类模式。使用分层平均连锁聚类方法与 TOM 相结合，作者成功地识别了每个基因网络内的不同基因模块。在热图中描述了此过程。此外，利用动态树切割算法，作者进一步将基因模块划分为三个子模块，这些发现与研究基因调控网络和功能模块具有生物学相关性。

相关基因模块的鉴定
与临床特征密切相关的基因模块通常具有重要和特定的生物学意义。蓝色和绿色模块与斑块破裂、进展和动脉粥样硬化表现出很强的相关性。蓝色模块与动脉粥样硬化斑块破裂 （r = 0.80，P = 1E-28） 和进展 （r = 0.78，P = 3E-26） 呈正相关， 而绿色模块与斑块破裂 （r = -0.66，P = 2E-16） 和进展  呈显著负相关，在动脉粥样硬化的背景下。进一步的分析强调了蓝色模块和 GS 之间的强相关性 （r = 0.59，P = 1.1E-74）  以及绿色模块与 GS 之间的相关性 （r = 0.52， P = 5.4E-47）。

基于机器学习的枢纽基因鉴定
最初，进行了维恩交集分析，以确定与不稳定动脉粥样硬化斑块显著相关的 1,288 个基因与一组 1,136 个线粒体基因之间的重叠。该分析产生了 50 个线粒体基因的子集。随后，基于 LASSO 回归，作者改进了这组基因并从 50 个线粒体基因中鉴定了 20 个关键基因。此外，使用 SVM-RFE 算法，还鉴定了另外 6 个关键基因最后，通过交叉从这两种机器学习方法获得的结果，发现了 6 个枢纽线粒体基因：NT5DC3、ACADL、SLC25A4、ALDH1B1、MAOB 和 KMO。

免疫细胞亚型分布模式的表征
使用 CIBERSORT 算法评估免疫细胞亚型分布模式，以比较对照和动脉粥样硬化样本之间的差异表达。相关矩阵分析显示 CD8 T 细胞和 M0 巨噬细胞之间存在负相关，热图分析显示对照和动脉粥样硬化样本之间免疫细胞比例的显着差异。动脉粥样硬化样本表现出 CD8 T 细胞浸润的普遍减少和 M0 巨噬细胞浸润的增加。补充表 10 提供了在动脉粥样硬化患者组中观察到的免疫细胞浸润模式的详细信息。进一步分析 显示 SLC25A4、 NT5DC3 、 ACADL 、 ALDH1B1 和 MAOB 与 CD8 T 细胞呈正相关 （P < 0.001），与 M0 巨噬细胞呈负相关 （P < 0.001）。相反，KMO 与 CD8 T 细胞呈负相关 （P < 0.001），与 M0 巨噬细胞呈正相关 （P < 0.001）。

50 条 HALLMARKS 通路的比较分析
进行差异分析以检查动脉粥样硬化患者免疫细胞亚型的分布。使用 GSVA 比较对照组和动脉粥样硬化患者 HALLMARKS 通路的差异（补充图 1）。此外，还评估了 6 个枢纽基因与 50 个 HALLMARKS 通路之间的相关性（补充图 D）。与对照组相比，动脉粥样硬化患者组在多个途径中的富集水平显著增加 （P < 0.001）。这些途径包括 KRAS 信号传导的上调、炎症反应、移植排斥反应、白细胞介素 2 （IL-2）/信号转导和转录激活因子 5 （STAT5） 信号传导、凝血、血红素代谢、紫外线 （UV） 反应下调、P53 信号传导、活性氧、磷酸肌醇 3-激酶 （PI3K）/蛋白激酶 B （Akt）/雷帕霉素的哺乳动物靶标 （mTOR） 信号传导、补体、干扰素-α 反应、干扰素-γ 反应、肌生成、细胞凋亡、肿瘤坏死因子 α （TNFA） 信号传导通过核因子-κB （NF-KB）、缺氧、白细胞介素 3 （IL-3）/Janus 激酶 （JAK）/信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 信号传导，以及外源性代谢途径。此外，发现 SLC25A4、 NT5DC3、 ACADL 、 ALDH1B1 和 MAOB 与多种途径呈负相关，例如外源性代谢、紫外线反应上调、紫外线反应下调、未折叠蛋白反应、通过 NFKB 的 TNFA 信号传导、TGF-β 信号传导、精子发生、活性氧、PI3K/Akt/mTOR 信号传导、过氧化物酶体、胰腺 β 细胞、 P53 信号传导、肌生成、MYC 靶标 V2 信号传导、mTORC1 信号传导、KRAS 信号上调、KRAS 信号下调、干扰素-α 反应、干扰素-γ 反应、炎症反应、IL-2/STAT5 信号传导、IL-3/JAK/STAT3 信号传导、缺氧、血红素代谢、刺猬信号通路、糖酵解、雌激素反应延迟、DNA 修复、补体、凝血、胆固醇稳态、细胞凋亡、顶端表面、脂肪生成、移植排斥反应、血管生成和雄激素反应。相比之下，KMO 与上述所有途径均呈正相关（补充表 11）。
KMO 作为评估动脉粥样硬化斑块不稳定性的潜在生物标志物
通过 ROC 曲线分析评估预测诊断性能，用于基于机器学习的中心基因表达水平选择。2，SLC25A4、NT5DC3、ALDH1B1、MAOB、KMO 和 ACADL 的 AUC 值分别为：0.843（95% 置信区间 [CI] 为 0.747–0.919）、0.845（95% CI 为 0.759–0.924）、0.809（95% CI 为 0.701–0.899）、0.8（95% CI 为 0.703–0.888）、0.823（95% CI 为 0.728–0.906）， 和 0.84 （95% CI 为 0.74-0.918）。
为了进一步验证这些生物标志物在评估动脉粥样硬化斑块不稳定性方面的诊断价值，作者进行了一项涉及收集人颈动脉粥样硬化斑块样本的研究。使用基于 AHA 分类的组织学分级半定量评分系统评估斑块稳定性（补充表 2）。与对照组相比，HE 染色显示稳定斑块组 （SAP） 的不同特征，包括泡沫细胞增加、脂质核心较小和炎症细胞浸润减少。相反，不稳定斑块组 （UAP） 表现出更大的动脉粥样硬化斑块、组织破裂、新生血管形成和炎症细胞浸润加剧。
进行 IHC 初步评估人颈动脉斑块组织中 KMO 、 ACADL 、 ALDH1B1、 MAOB 、 NT5DC3 和 SLC25A4 的表达 ，作者的研究结果显示，KMO 表达在对照组、 SAP 和 UAP 组的组比较中有所不同，不仅在对照组和 SAP 组之间 （P < 0.01） 而且在对照组和 UAP 组之间也存在显著差异 （P < 0.001）。此外，当比较 SAP 组和 UAP 组时，KMO 表达表现出显着差异 （P < 0.001）。同样，对照组的 MAOB 和 ALDH1B1 表达也与 SAP 组和 UAP 组存在显著差异 （均 P < 0.001），但 SAP 组和 UAP 组之间未观察到显著差异 （P > 0.05）。

同时，RT-qPCR 结果显示，对照组 KMO mRNA 表达水平与 UAP 组 （P < 0.01） 和 SAP 组 （P < 0.01） 存在显著差异;此外，SAP 组和 UAP 组之间也观察到显著差异 （P < 0.001） 。同样，对照组的 ALDH1B1 和 MAOB mRNA 表达与 SAP 组 （P < 0.001） 和 UAP 组 （P < 0.001） 的表达差异显著，而 SAP 组和 UAP 组之间没有观察到显著差异 （P > 0.05） 。

IHC 和 RT-qPCR 结果一致表明，与对照组相比，动脉粥样硬化稳定和不稳定斑块中 KMO 表达显著上调，SAP 组和 UAP 组之间存在明显差异。同样，与对照组相比，MAOB 表达表现出显着的上调。然而，SAP 组和 UAP 组之间未观察到显著差异。相反，ALDH1B1表达显示稳定和不稳定的动脉粥样硬化斑块均显著减少，SAP 组和 UAP 组之间无显著差异。因此，KMO 基因有望成为识别不稳定斑块的潜在诊断和预测生物标志物。
KMO：巨噬细胞和线粒体中的双重定位
为了探索 KMO 在人动脉粥样硬化斑块组织和细胞中的亚细胞定位，作者在人颈动脉不稳定斑块中对 KMO 和巨噬细胞标志物 CD68 进行了免疫荧光共染色的结果揭示了 KMO 在 CD68 阳性巨噬细胞内的共定位，这与作者在公开可用的人类颈动脉粥样硬化数据集上利用 WGCNA、机器学习和免疫细胞浸润分析的研究结果一致。为了进一步验证 KMO 作为线粒体基因，作者培养了 RAW264.7 细胞系，并使用线粒体特异性抗体 TOM20 对 KMO 进行了共染色。KMO 和线粒体特异性抗体 TOM20 的共定位分析表明它们在巨噬细胞线粒体内的信号重叠。这些发现为 KMO 在动脉粥样硬化病变内巨噬细胞中的表达以及 KMO 作为线粒体基因的作用提供了令人信服的证据。
在 HCD 喂养的 ApoE – / – 小鼠中通过沉默 KMO 减轻动脉粥样硬化斑块的形成并增强斑块稳定性
在 ApoE – / – 小鼠中，作者在慢病毒转导后 2 周和 20 周检测到该构建体在主动脉中的表达。主动脉根部的冰冻切片显示 EGFP 荧光，蛋白质印迹分析显示两组之间的主动脉 KMO 蛋白水平存在显著差异（图 D）。10C 和 D），表明 Sh-KMO 转导在 ApoE – / – 小鼠的主动脉壁中成功。HF 饮食 20 周后，对 ApoE – / – 小鼠实施安乐死，并从眼眶静脉采集血样。使用 HE 和 Masson 三色染色对主动脉根部切片进行的组织学分析表明，HF 饮食显着增加了主动脉斑块面积、坏死的核心区域、胶原阳性区域和血清低密度脂蛋白胆固醇水平，在 ApoE – / – 小鼠中。HE 染色显示 Sh-KMO 转导的小鼠主动脉斑块面积减少 和坏死核心区域。Masson 的三色染色显示，Sh-KMO 转导的小鼠胶原蛋白阳性面积增加，表明 KMO 促进动脉粥样硬化斑块的形成和不稳定性。
KMO 作为 ACS 的诊断生物标志物
与对照组相比，SA 患者血清 KMO 和 hs-CRP 水平显著升高。同样，与对照组相比，ACS 患者的 KMO 和 hs-CRP 水平显著升高，在将 ACS 与 SA 进行比较时观察到的差异甚至更大。对照组平均 KMO 水平为 198.8 ng/L，SA 组为 210.0 ng/L，ACS 组为 237.2 ng/L。对照组平均 hs-CRP 水平为 3.56 mg/L，SA 组为 4.07 mg/L，ACS 组为 4.63 mg/L。ROC 曲线分析表明 KMO 区分 SA 与对照组的 AUC 为 0.73 （95% CI 0.58–0.87，P = 0.007），敏感性 为 0.92，特异性为 0.58。对于 ACS 与对照组的比较，KMO 的 AUC 为 0.95 （95% CI 0.89-1.00，P < 0.0001），敏感性为 0.88，特异性为 0.96。当将 ACS 与 SA 进行比较时，KMO 的 AUC 为 0.89 （95% CI 0.79–0.98，P < 0.0001），敏感性为 0.79，特异性为 0.83。此外，hs-CRP 区分 SA 与对照组的 AUC 为 0.71 （95% CI 0.57–0.87，P = 0.009）， 敏感性为 0.67，特异性为 0.75。对于 ACS 与对照组的比较，hs-CRP 的 AUC 为 0.82 （95% CI 0.70–0.94，P < 0.0001），敏感性为 0.71，特异性为 0.87。当将 ACS 与 SA 进行比较时，hs-CRP 的 AUC 为 0.71 （95% CI 0.56–0.87，P = 0.011），敏感性为 0.71，特异性为 0.75，值得注意的是，在区分 ACS 和 SA 方面，KMO 的 AUC 曲线下面积及其敏感性和特异性显著大于 hs-CRP，表明与 hs-CRP 相比，KMO 可能具有更强的区分 ACS 和 SA 的能力。这些发现为进一步探索 KMO 在 CAD 和 ACS 诊断中的临床效用提供了基础。

总结

总之，作者的研究将 KMO 确定为与免疫系统相关的线粒体靶向基因，证明了它作为评估动脉粥样硬化斑块不稳定性的有前途的诊断生物标志物的潜力。作者的结果表明，M0 巨噬细胞可能有助于动脉粥样硬化斑块的发生和发展，而 CD8 T 细胞可能发挥保护作用。此外，作者观察到 KMO 表达与 M0 巨噬细胞呈正相关，与 CD8 T 细胞呈负相关。这些发现强调了 KMO 在与巨噬细胞相互作用中的重要作用，阐明了它与动脉粥样硬化斑块发展和进展的相关性。因此，作者的研究为基础研究提供了新的见解，并为开发针对动脉粥样硬化相关疾病的预防和治疗策略提供了潜在途径。