3.1. APS 干预对 NaF 诱导大鼠体重、肝功能、氧化应激和炎症反应的影响
为了评估 APS 对 NaF 诱导的肝损伤的保护作用，作者进行了一项动物实验，如图 1 A 所示。 结果表明，APS 减弱了 NaF 诱导的大鼠生长迟缓。 这一发现已发表在先前的研究中（Zhang et al.， 2025）。在第 12 周测量肝脏指数。 如图 1 B 所示，NaF 组的肝脏指数显著高于对照组（p < 0.05）。 与 NaF 组相比，ANL、ANM 和 ANH 组的肝脏指数均显著降低（p < 0.05）。 肝脏 ALT 和 AST 水平是肝损伤的关键指标（ 图 1 C-D）。 与对照组相比，NaF 组的 ALT 和 AST 水平显著升高（p < 0.01）。 与 NaF 组相比，ANL 组和 ANM 组的 ALT 水平显著降低（p < 0.05），而 ANH 组的下降更为明显（p < 0.01）。 所有 APS 干预组（ANL、ANM、ANH）的 AST 水平均显著低于 NaF 组（p < 0.05）。 为了评估 APS 介导的 NaF 诱导的肝组织氧化损伤的改善，作者测量了 SOD、CAT 的活性以及 GSH 和 MDA 的水平（ 图 1 E-F）。 与对照组相比，NaF 组的 MDA 水平显著升高（p < 0.01），GSH 水平、SOD 活性和 CAT 活性显著下降（p < 0.01）。 相比之下，与 NaF 组相比，ANL、ANM 和 ANH 组的 SOD、CAT 活性和 GSH 水平呈剂量依赖性增加，MDA 水平显著降低（p < 0.01）。 为了评估 APS 对 NaF 诱导的肝脏炎症的抗炎作用，定量了肝组织中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α的水平（ 图 1 G）。 NaF 组显示出显著高于对照组的这些促炎细胞因子水平（p < 0.05）。 相反，与 NaF 组相比，所有 APS 干预组的 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平均显着降低 （p < 0.05）。
图 1.APS 减轻了 NaF 诱导的大鼠肝损伤。（A）NaF 模型方案和药物治疗。（B）大鼠肝脏指数变化。（C）血清 ALT 活性。（D）血清 AST 活性。（E-F）肝组织 SOD、CAT 活性和 GSH、MDA。（G）炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α水平。（H）H&E 染色。黑色实心箭头表示肝细胞局灶性坏死。黑色虚线箭头表示炎症细胞浸润。比例尺分别代表 100 μm 和 50 μm。（I）透射电镜肝脏超微结构特征（15000 ×，红色箭头表示线粒体肿胀，黄色箭头表示线粒体自噬，蓝色箭头表示脂滴，*表示核染色质丢失，N：细胞核，m：线粒体，au：自噬溶酶体 er：内质网;比例尺 = 1 μm）。（J） 肝脏组织病理学评分 （H&E）。（n = 6，*p < 0.05，** p < 0.01，表示与 CG 组相比;# p < 0.05，## p < 0.01，表示与 NaF 组相比。
3.2. APS 干预对氟化钠诱导的肝脏形态学和超微结构损伤的影响
HE 染色大鼠肝组织病理学结果如图 1 H 所示。 CG 组和 APS 组肝小叶明显，肝细胞排列有序，形态正常，无明显病理改变。 相比之下，NaF 组表现出弥漫性肝充血、散在性点状坏死和炎症细胞浸润。 与 NaF 组相比，ANL 组和 ANM 组点状坏死灶数量减少，炎症细胞浸润减弱。 ANH 组肝组织仅出现轻度点状坏死。
大鼠肝脏的超微结构分析如图 1 I 所示。 在 CG 和 APS 处理组中，肝细胞表现出规则的核形态，核膜完整，染色质分布均匀。 线粒体表现出明显的结构完整性，嵴排列有序，没有观察到的异常。 在 NaF 组中，肝细胞表现出明显的超微结构损伤：核染色质表现出部分丢失，线粒体肿胀，线粒体自噬和细胞质脂滴积累明显。 与 NaF 组相比，ANL 组和 ANM 组线粒体肿胀适度减轻。 ANM 组未表现出可检测到的线粒体自噬，而 ANL 组仍表现出偶尔的自噬体形成。 ANH 组肝核形态正常，线粒体肿胀基本消退，嵴结构近乎完整; 仅检测到罕见的线粒体自噬。
3.3. 网络药理学揭示了 APS 在 NaF 诱导的肝损伤中的潜在机制
利用 TCMSP、GeneCards、SwissTargetPrediction 和 OMIM 数据库筛选了 7 种 APS 生物活性化合物，得出了 208 个潜在靶点。 同时，检索到 317 个“NaF 诱导的肝损伤”的疾病相关靶点。 通过维恩图分析，确定了 34 个交集的蛋白质靶点作为 APS 保肝作用的潜在介质。 将这些靶标导入 STRING 数据库（置信度评分≥0.7），并使用 Cytoscape 3.9.1 可视化以构建 PPI 网络。 如图 2 A 所示，通过对度中心性、中间中心性和接近性中心性 3 个拓扑参数进行综合排序，确定了包括 STAT3 和 CASP3 在内的前 9 个核心靶点。 “成分-靶点”PPI 网络（ 图 2 B）直观地说明了 APS 通过其活性成分靶向和调节关键基因的潜在治疗途径。 GO 功能富集分析（ 图 2 C）显示，这些靶点主要参与脂质代谢过程、炎症反应等。 KEGG 通路分析（ 图 2 D）显示，“IL-17 信号通路”和“糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路”等通路中靶点显著富集。
图 2.网络药理分析和转录组学分析。 （A）PPI 网络; （B）APS 成分基因药物性肝损伤; （C）GO 富集分析结果; （D）KEGG 富集分析气泡图。 （E）（NaF 与 GC）和（APS_NaF 与 NaF）之间 DEG 的维恩图。 （F）NaF 与 GC 的 DEGs 火山图; （G）APS_NaF 与 NaF 的 DEGs 火山图; （H）NaF 与 GC 的 DEGs 聚类热图; （I）APS_NaF 与 NaF 的 DEGs 聚类热图。
3.4. APS 治疗 NaF 诱导的肝损伤的转录组学分析结果
在这项研究中，RNA 测序（RNA-seq）用于检查 NaF 诱导的肝损伤和 APS 干预之间肝转录组的差异。 9 个样本产生了 61.54 Gb 的高质量数据（Q30>98.47%）。 与 CG 组相比，NaF 组有 1294 个上调基因和 446 个下调基因。 与 NaF 组相比，ANH 组表现出 520 个上调基因和 1630 个下调基因。 两组共有 1378 个差异表达基因被 NaF 诱导，APS 逆转（ 图 2 E-G）。 对前 100 个差异表达基因进行分层聚类分析显示，两组之间存在显著差异[ 图 2 H-I]。
GO 分析表明，NaF 诱导的差异表达基因在“氧化还原过程”和“炎症反应”、“蛋白质结合”以及“质膜”和“线粒体”中均显著富集。 APS 干预后，观察到类似的富集曲线（图 S1 A-B）。 KEGG 通路分析显示，NaF 组富集了“NF-κB 信号通路”和“类固醇激素生物合成”，ANH 组富集了“细胞因子-细胞因子受体相互作用”和“Th17 细胞分化”。 两组均参与了“糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路”、“PPAR 信号通路”和“药物代谢-细胞色素 P450”等核心通路（图 S1 C-D）。
进一步筛选 APS 逆转的关键基因：1108 个 NaF 上调/APS 下调基因在炎症通路中显著富集，包括“NF-κB 信号通路”和“Th17 细胞分化”（ 图 3 A、C、E）。 相反，269 个 NaF 下调/APS 上调的基因富集在代谢途径中，如“药物代谢-细胞色素 P450”和“PPAR 信号通路”（ 图 3 B、D、F）。
图 3.转录组学分析。（A）APS_NaF 与 NaF 下调，NaF 与 GC 上调的 DEGs 的翻转图;（B）DEGs 被 APS_NaF 与 NaF 上调，被 NaF 与 GC 下调的 DEGs 的颠覆图;（C）被 NaF 激活但被 APS 抑制的 DEGs 的 GO 功能注释分析;（D）受 NaF 抑制但 APS 激活的 DEGs 的 GO 功能注释分析;（E）被 NaF 激活但被 APS 抑制的 DEGs 的 KEGG 富集分析;（F）被 NaF 抑制但被 APS 激活的 DEGs 的 KEGG 富集分析。
3.5 APS 治疗 NaF 诱导的大鼠肝损伤的代谢组学分析结果
与 NaF 组相比，采用 UHPLC-Q-TOF/M 检测 ANH 组正/负离子模式的差异代谢物分别为 33 种和 15 种（ 图 4 A-B）。 将 NaF 组与 CG 进行比较，鉴定出 22 种和 14 种差异代谢物（ 图 S3 A-B）。
图 4.代谢组学分析。（A）正离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的 PCA 分析;（B）负离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的 PCA 分析;（C）正离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的 OPLS-DA 分析;（D）负离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的 OPLS-DA 分析;（E）正离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的 OPLS-DA 排列图分析;（F）负离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的 OPLS-DA 排列图分析。
多因素统计分析显示，PCA 评分图显示实验组之间的肝脏代谢特征存在显着差异（ 图 4 C-D）。 OPLS-DA 评分图进一步证实了两种离子模式下 NaF 组和对照组（图 S2 E-F）以及 APS 组和 NaF 组（ 图 4 E-F）之间的明显分离。 经过 200 次排列检验，NaF 与 CG 以及 APS 与 NaF 比较的 R² 和 Q² 值低于原始模型值 （p < 0.05; 图 S2 G-H 和图 4 G-H），表明模型过拟合风险低，可靠性高。
基于变量重要性预测（VIP>1.0，p < 0.05），ANH 组与 NaF 组比较共鉴定出 48 个显著性 DAM。 主要类别包括脂质和脂质样分子（31.72%）（ 图 5 C）。 在正离子模式下，18 种代谢物上调，15 种下调，而在负离子模式下，3 种上调，12 种下调（ 图 5 A-B）。 与 CG 组相比，NaF 组在正离子模式下表现出 15 种上调和 7 种下调的代谢物，在负离子模式下表现出 3 种上调和 11 种下调的代谢物（图 S3 A-B）。
图 5.代谢组学分析。（A）在正离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的上调和下调不同表达代谢物分析;（B）负离子模式下 APS_NaF 与 NaF 的上调和下调不同表达代谢物分析;（C）基于 HMDB 数据库的代谢物分类;（四）KEGG 通路富集分析。
ANH 组 KEGG 通路富集分析显示，差异代谢物在淀粉和蔗糖代谢、NF-κB 信号通路、胆固醇代谢和药物代谢细胞色素 P450 等通路中显著富集。NaF 与 CG 组的比较如图 S3C 所示，ANH 与 NaF 组的比较如图 5 所示。
3.6. APS 对 NaF 诱导的肝损伤的保护作用综合分析
综合网络药理学和转录组学分析表明，9 种常见途径可作为 APS 干预 NaF 诱导肝损伤的潜在靶点。其中包括“糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路”、“Th17 细胞分化”和“胆汁分泌”（ 图 6 A）。通过转录组学和非靶向代谢组学相结合的进一步验证表明，糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路和 NF-κB 信号通路等通路显着富集（ 图 6 B）。
图6.APS治疗NaF诱导肝损伤的多组学综合分析。（A）网络药理学和转录组学的常见途径。（B）转录组和代谢组中KEGG富集的P值条形图。（C）计算Spearman相关系数，分析基因与代谢物之间的关系。红色代表正相关，蓝色代表负相关。（*， < 0.05， **， < 0.01 re对两个参数之间的显着差异感到不满）。（D）APS的主要化合物作用于Th17细胞分化中的基因和代谢物、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、NF-κB信号通路、PPAR信号通路、胆汁分泌、药物代谢-细胞色素P450。绿色节点代表活性化合物，中间节点代表基因，黄色节点代表代谢物。
Spearman相关性分析显示，这些共同途径中的DEGs与参与脂质代谢的DAMs之间存在显著相关性（6 C，）。
图7.关键基因和蛋白质的表达。（A）qRT-PCR分析5个候选单基因的表达;（B）电泳图;（C-F）p65、p-p65、PPARγ 和 CYP2E1 的相对蛋白表达水平分别为（n = 3，** < 0.01 CG vs NaF;## < 0.01 ANH vs NaF ）。
此外，利用Cytoscape 3.9.1通过整合APS活性成分、候选靶点途径和相应的DEG/DAMs，构建“活性成分-基因-代谢物-途径”的相互作用网络（D）。结果表明，APS活性成分可以通过调控“NF-κB信号通路”、“药物代谢-细胞色素P450”和“胆汁分泌”通路中的关键基因和代谢物来发挥其作用。这可视化了APS“多组分-多靶点-多途径”协同干预NaF诱导肝损伤的潜在机制。
3.7. APS对NaF诱导的肝损伤的保护作用的验证分析
qRT-PCR验证了5个与炎症反应和药物代谢相关的关键基因的表达水平，与转录组测序数据一致。在NaF组中，炎症相关基因Relb和显著上调，而在APS干预组中则下调。相比之下，NaF组下调的药物代谢和解毒相关基因、和在APS治疗后显著上调（A）。Western blot分析（ B-F）显示，与CG组相比，NaF组p-p65蛋白水平显著升高（ < 0.01），PPARγ和CYP2E1蛋白水平显著降低（ < 0.01），而总NF-κB p65无显著变化。与NaF组相比，ANH组p-p65显著下调（ < 0.01），PPARγ和CYP2E1显著上调（ < 0.01）。
总结
本研究通过动物实验和多组学分析，阐明 APS 对 NaF 诱导的肝损伤的保护机制可能与以下 3 个途径有关：通过调节 NF-κB/AGE-RAGE/Th17 信号通路抑制肝细胞炎症反应，通过激活 PPAR 信号通路改善脂质代谢紊乱，协同上调代谢酶相关基因（ 如 Cyp2e1）的表达， Gsta1 和 UGT，可增强肝脏解毒能力。研究结果为扩大 APS 在地方性氟中毒中的临床应用提供了理论支持。未来可以扩大样本量，并结合细胞实验，深化机制验证。同时，可以探索超声响应水凝胶等新的递送技术，以提高 APS 的靶向和干预效果。
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